CM-02. Подавление цитотоксической функции NK-клеток провоспалительными цитокинами при остром и хроническом миелоидном лейкозе

Резюме

Натуральные киллеры (NK-клетки) обладают противоопухолевой активностью, опосредованной секрецией цитотоксических гранул при взаимодействии с трансформированными клетками. Количество зрелых NK-клеток позитивно коррелирует с благоприятным прогнозом при oстрoм (ОМЛ) и хроническом (ХМЛ) миелоидном лейкозе. Однако, у пациентов с миелолейкозом созревание и цитотоксичность NK-клеток подавлены, причем роль внеклеточного окружения в данном нарушении мало изучена. Поскольку концентрации воспалительных цитокинов (IL 1β, IL-6, TNFα) повышены в тканях пациентов с ХМЛ и ОМЛ, мы предполагаем, что данные молекулы препятствуют нормальному функционированию NK-клеток.

Материалы и методы

Для выявления эффекта воспалительных цитокинов на функцию NK-клеток с помощью проточной цитометрии и секвенирования РНК, мы использовали химерные мышиные модели BCR-ABL⁺ (ХМЛ) и Flt3-ITD/TET2^−/− (ОМЛ) наряду с образцами мононуклеарных клеток периферической крови и костного мозга пациентов с миелолейкозом. Для получения химерных мышей, CD45.2⁺ клетки костного мозга, несущие онкогенную мутацию, были пересажены здоровым CD45.1⁺ мышам линии C57BL/6.

Результаты

Количество NK-клеток у мышей с обоими видами лейкоза было снижено по сравнению с контролями. Более того, наблюдалось нарушенное созревание NK-клеток, потеря ими активирующих рецепторов и повышенная экспрессия ингибиторных молекул Lag-3, TIGIT, NKG2A. Цитотоксическая функция NK-клеток (дегрануляция ex vivo в присутствии клеточной линии Yac-1) оказалась снижена. Данные результаты согласуются с известными клиническими наблюдениями, подчеркивая релевантность мышиных моделей. Для выявления процессов, специфичных NK-клетам при миелолейкoзе, мы охарактеризовали их транскриптом у здоровых мышей и мышей с ХМЛ. Cеквенировaние РНК единичных клеток подтвердило сниженную экспрессию маркеров созревания и цитотоксичности (Itgam, Cx3cr1, Prf1, Gzma) при ХМЛ. Кроме того, NK-клетки при лейкoзе сверхэкспрессировали гены, связанные с воспалительным ответом. Повышенная эспрессия РНК наблюдалась для таких цитокинов, как IL 1β, TNFα, GM-CSF, а также рецепторов цитокинов и негативных регуляторов STAT3/5 сигнальных каскадов. Более того, анализ биологических путей выявил активацию IL-6/STAT3 и NF-kB сигналинга, что вероятно связано с повышенным уровнем воспалительных цитокинов в тканях при ХМЛ. Так, следующим шагом стало тестирование эффекта тканевого окружения ХМЛ на функцию NK-клеток ex vivo. Мы обнаружили значительно сниженную дегрануляцию здоровыми NK-клетками после инкубации с сывороткой крови мышей с ХМЛ, по сравнению с сывороткой контрольных мышей. Чтобы определить возможные факторы, нарушающие функцию NK-клеток, мы сравнили концентрации ~200 молекул в данных сыворотках путем ИФА. Повышенными при ХМЛ оказались такие цитокины, как IL-6, IL-1α/β, TNFα, и GM-CSF, часть из которых, по результатам РНК-секвенирования, могут секретировать NK-клетки. ОТ-кПЦР подтвердила повышение экспрессии мРНК, кодирующих IL-1β, TNFα и GM-CSF, в NK-клетках при ХМЛ. Данные результаты указывают на возможный вклад NK-клеток в воспаление, что, в комбинации с нарушением их цитотоксической функции, усугубляет лейкоз. Для оценки применимости полученных результатов в клинической практике, мы охарактеризовали NK-клетки у здоровых доноров и пациентов с ХМЛ и ОМЛ. В соответствии с известными данными, у пациентов наблюдалось меньшее число NK-клеток, снижение способности NK-клеток к дегрануляции и эспрессии активирующих поверхностных рецептов (например, NKG2D и DNAM-1 при ОМЛ). Уровень ингибиторных рецепторов (KIR2DL1, NKG2A) был повышен. Секвенировaние РНК NK-клеток подтвердило результаты, полученные на мышиных моделях, и показало активацию NF-kB, TNF, и PI3K-Akt сигнальных каскадов при миелолейкозе. Последнее указывает на чувствительность NK-клеток к провоспалительным цитокинам, что может препятствовать их эффективному противоопухолевому ответу.

Выводы

Наши данные подчеркивают роль цитокинов, ассоциированных с ХМЛ и ОМЛ, в нарушении функционирования NK-клеток и указывают, что воспалительные процессы являются потенциальной мишенью при иммунотерапии миелолейкозa.

Ключевые слова

NK-клетки, воспаление, иммунотерапия, острый миелобластный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз.