Использование экспрессии гранзима В в Т регуляторных клетках у пациентов с «классической» иммуносупрессией на +30 день после алло-ТГСК в качестве предиктора развития острой реакции «трансплантат против хозяина»

Резюме

Введение

Гранзим В представляет собой сериновую протеазу широко встречающуюся в гранулах цитотоксических Т лимфоцитов и натуральных киллеров. Он секретируется совместно с формирующим поры белком перфорином, что приводит к индукции апоптоза в клетках-мишенях. Цитолиз клеток опосредуемый гранзимом В, является одним из механизмов, который используют Т регуляторные клетки (Трег) для воздействия на цитотоксические лимфоциты. Несмотря на хорошо известный факт, что Трег участвуют в патогенезе острой реакции трансплантат против хозяина (оРТПХ) и их количество после алло-ТГСК обратно коррелирует с вероятностью развития оРТПХ, данные о функциональном состоянии Трег при оРТПХ по-прежнему ограничены.

Пациенты и методы

Образцы периферической крови от 29 больных с гемобластозами отбирали в пробирки с ЭДТА на +30 день после алло-ТГСК. В связи с выраженной лимфопенией, что затрудняло анализ субпопуляции Трег, у этой группы пациентов для исследования выделяли достаточное количество мононуклеаров на градиенте плотности (ρ=1,077 г/ мл). В первую группу - без каких-либо проявлений оРТПХ за время наблюдения было включено 22 пациента (ОМЛ n=12, ОЛЛ n= 5, ЛПЗ n= 1, ХМЛ n= 2, АА n= 1, МДС n= 1). Из них 17 алло-ТГСК были выполнены от неродственных совместимых доноров, в 5 случаях - от неродственных несовместимых доноров. В 17 случаях был использован миелоаблативный режим, 5 пациентам был проведен режим кондиционирования пониженной интенсивности. Во вторую группу пациентов, с развитием оРТПХ после дня +30, были включены 7 пациентов: с ОМЛ (n= 4) и ОЛЛ (n = 3). Из них в 5 случаях алло-ТГСК проводилась от неродственного совместимого донора, в одном – от неродственного несовместимого донора, и у 1 пациента донором был HLA-идентичный сиблинг. Двум пациентам был проведено миелоаблативное кондиционирование, а 5 пациентам - режим с пониженной интенсивностью. Все пациенты в обеих группах получали стандартную профилактику РТПХ (ММФ + ЦСА + АТГ). У всех пациентов во второй группе (с оРТПХ после +30 дня) была констатирована оРТПХ II-IV степени (II (n = 1); III (n = 4); IV (n = 2)). Медиана развития РТПХ составила 50 сут. (34-150). Для определения доли гранзим В-позитивных Трег были использованы антитела к CD4-АРС-Cy7, CD25-APC, CD127FITC и Granzyme B-PE (Becton Dickinson, USA). Учитывая наличие нескольких методов для идентификации Трег: а именно как CD4+CD25high и CD4+CD25highCD127low популяции, с целью сравнения этих двух способов измерения нами предварительно был выполнен анализ по методу Блэнда-Алтмана. Сравнительный анализ этих результов не показал различий по этим двум методам при измерении доли гранзим В-позитивных Трег (р = 0,942). В связи с этим, в дальнейших экспериментах, с целью повышения воспроизводимости результатов, Трег идентифицировались как клетки с фенотипом CD4+CD25high (Gregg et al., 2005). Для достижения достаточной статистической мощности анализировали 30000 CD4+ клеток. Анализ проводили на проточном цитометре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США).

Результаты

Из рис. 1 видно, что доля гранзим В-позитивных Трег была выше у пациентов, у которых не наблюдалась оРТПХ. На рис. 2 видно, что доля гранзим В-положительных Трег в группе пациентов, у которых не было отмечено признаков оРТПХ, составила 7,26 ± 1,89%, будучи достоверно выше, чем в группе с оРТПХ (2,04 ± 0,93%; р=0,02). Следует отметить, что, согласно нашему предыдущему анализу, бактериальная и/или вирусная инфек- ция, а также различие по HLA не оказывают влияние на долю гранзим В-позитивных Трег после алло-ТГСК. Далее нами была выполнена попытка использования доли гранзима В в Трег как прогностического маркера оРТПХ после +30 дня. На рис. 3 отображены результаты ROC-анализа. По нашим данным, показатель AUC («площадь под кривой») составил 0,74.

Выводы

Согласно полученным нами данным, доля Гранзим В-позитивных Трег у пациентов со стандартной профилактикой, может быть использована для прогнозирования оРТПХ после +30 дня с удовлетворительными результатами (AUC: 0,74; «cut-off»: 4,15%; чувствительность: 85,71%; специфичность: 45,45%). По данным нашего трансплантационного центра за 2006-2016 год, анализ экспрессии гранзима В в Трег как прогностического маркера позволяет предсказать до 47,3% случаев оРТПХ.

Ключевые слова

алло-тгск, гранзим в, т-регуляторные клетки, ортпх, прогностический маркер