Функциональные различия в составе Т-лимфоцитов трансплантатов: экспериментальные данные

Резюме

Введение

Хорошо известен факт, что при использовании в качестве трансплантата мобилизованных стволовых клеток крови (СКК) время восстановления количества нейтрофилов значимо меньше, чем при использовании костного мозга (КМ). В то же время частота развития острой реакции трансплантат против хозяина (оРТПХ) значимо ниже при использовании КМ, чем при СКК. Почти все авторы объясняют эти факты различным количеством Т-лимфоцитов (CD3+) в трансплантате, акцентирую свое внимание на эффекторной субпопуляции Т-клеток (CD3+CD8+). Однако практически нет данных о функциональных различиях в составе другой не менее важной популяции клеток, а именно субпопуляции Т-хелперов (CD3+CD4+), которые ответственны за регуляцию практически всех процессов в Т-клеточном звене иммунной системы. Функциональные свойства Т хелперов - принадлежность к той или иной функционально активной популяции могут быть определены по виду цитокина, который он секретирует при стимуляции его Т-клеточного рецептора (ТКР). Для неспецифической стимуляции ТКР используются суперантигены (сАГ). Использование сАГ вызывает независимую от Vβ-домена ТКР, стимуляцию, а также приводят к формированию функционально активных связей между ТКР и главным комплексом гистосовместимости (ГКС) антиген-презентирующих клеток (АПК). Таким образом, под действием сАГ в течение нескольких часов Т-лимфоциты начинают секретировать цитокины, по которым клетку можно отнести к той или иной функционально активной субпопуляции хелперов. Далее нами представлены данные по исследованию функционального состава Т-хелперов трансплантатов, полученных от здоровых доноров.

Пациенты и методы

В исследование были включены 9 образцов трансплантатов, полученных от здоровых доноров (КМ: n=3, СКК: n=6). СКК были получены путем афереза у донора после стимуляции его гемопоэза в течение 5 дней Г-КСФ в дозе 10 мкг/кг. Один миллион клеток полученный из трансплантата в среде RPMI-1640 (в присутствии 10% аутологичной сыворотки) инкубировали с сАГ в рекомендованной концентрации. В качестве сАГ для стимуляции Т- клеток использовали Cytostim (Miltenyi Biotec, Германия). Спустя 2 часа после начала стимуляции с целью выполнения в дальнейшем внутриклеточного окрашивания добавляли блокатор белкового транспорта - брефелдин A. После этого клетки продолжали инкубировать еще в течение 4 часов при 37°C, CO2 - 5%. В дальнейшем было выполнено внутриклеточное окрашивание согласно стандартному протоколу (Cytofix/ Cytoperm, BD, USA). Для идентификации Т-хелперов использовали моноклональные антитела к антигенам CD45-APC , CD4-APC-Cy7, FoxP3-PerCP-Cy5.5, IL-17APE фирмы BD и CD294-FITC фирмы Biolegend, антиINF-γ-PE-Cy7 (см рисунок 1) (Th1:CD45+CD4+INF-γ+; Th2:CD45+CD4+CD294+ ;Treg:CD45+CD4+FoxP3+; Th17:CD45+CD4+IL-17A+). 30000 CD4+ клеток анализировали на проточном цитометре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, USA).

Результаты и обсуждение

Как представлено на рисунке 2 (слева) все образцы костного мозга имеют равное соотношение Th1:Th2:Treg:Th17 клеток, которое не отличается от того, что наблюдается в периферической крови (ПК) здоровых доноров. Вероятно, это связано с тем, что все Т-лимфоциты КМ являются лимфоцитами ПК, попавшими в трансплантат во время эксфузии костного мозга. С другой стороны, в СКК (рисунок 2, справа), все образцы трансплантатов имеют различное соотношение Th1:Th2:Treg:Th17 клеток. Учитывая широкое распространение, которое получило абсолютное количество CD34+ клеток при характеристике трансплантатов в клинической практике, а также исходно различное число ядросодержащих клеток в каждом из трансплантатов, мы рассчитали какое число Th1, Th2, Treg, Th17 клеток приходится на 100 CD34+ клеток (нормализовали на число CD34+ клеток) в КМ (рисунок 3, слева) и СКК (рисунок 3, справа). Как видно из рисунка 3 (справа), соотношение Th1, Th2, Treg, Th17 к CD34+ клеткам в СКК может варьировать (отличаться до 40 раз!) от образца к образцу.

Заключение

Таким образом, стимуляция Т-лимфоцитов трансплантата сАГ in vitro может отражать те процессы, которые происходят с Т-клетками in vivo после трансфузии, и может быть использована как модель для изучения влияния функционального состава трансплантата на развитие оРТПХ, отторжения и других процессов, в которых Т-клетки трансплантата принимают непосредственное участие. Наши предварительные данные показывают, что функциональный состав Т-лимфоцитов трансплантата очень вариабелен от образца к образцу и может влиять на процессы, которые происходят в иммунной системе реципиента после трансфузии трансплантата.

Ключевые слова

Т-регуляторные клетки, Стволовые клетки крови, трансплантат, Т хелперы, Тh17, th1, th2, костный мозг, острая РТПХ