Оценка энергетического потенциала свежих и хранимых клеток костного мозга с помощью флуоресцентного потенциал-чувствительного зонда

Резюме

Костный мозг является основным источником гемопоэтических стволовых клеток при клинической трансплантации. Качество трансплантатов костного мозга – ключевой фактор их успешного приживления. Целью нашей работы была проверка полуколичественной методики определения жизнеспособности при хранении в «голодной» среде с помощью флуоресцентного потенциал-чувствительного зонда 2-Di-1-ASP. Мы исследовали 20 образцов клеток костного мозга (ККМ), которые помещали в стандартный стабилизирующий раствор с цитратом натрия, лимонной кислотой, солями фосфатов, декстрозой и аденином. Подсчет клеток и тесты на выживаемость проводили на протяжении 72 часов хранения. Образцы клеток метили зондом 2-Di-1-ASP в определенные сроки. Интенсивность флуоресценции измеряли по отдельным клеткам, рассчитывали средние значения флуоресценции и число миелокариоцитов на образец. Митотические индексы определяли как в препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимза, так и после окраски флуоресцентным зондом. Для статистической обработки использовали методы кластерного анализа и стандартные непараметрические тесты. Результаты: Выживаемость ККМ в течение 0-5 часов составляла 80-92% (по тесту с трипановым синим), затем постепенно снижалась до 70-75% к концу сроков хранения. Далее, 3-часовая инкубация ККМ сопровождалась повышением интенсивности флуоресценции (F̃) с данным зондом, главным образом, из-за нарастания доли ярко светящейся субпопуляции (>100 усл.ед., N_F>100,%). Повышение значений D (отношения N_F>100,% через 3 часа хранения к N_F>100,% в исходных пробах) оказалось наиболее информативным, что позволяет прогнозировать специфические величины F̃ на более поздних сроках. Повышение F̃ по сравнению с исходными значениями в этот срок отмечалось во всех образцах ККМ за счет ярко светящихся форм (N_F>100), что коррелировало с ростом числа клеток. Дополнительный кластерный анализ позволил классифицировать образцы ККМ на 3 подгруппы в связи сдостоверными различиями по значениям D и изменениям клеточности. В частности, значительное число митотических форм наблюдалось в популяциях ККМ псле 5-24 часов хранения, и они ярко окрашивались зондом 2-Di-1-ASP probe. В целом, мы выявили 0,60±0,10% метафазных клеток в исходный срок наблюдения. По мере хранения, частота митотических фигур повышалась до 1,4±0,1%, а, после 6-часовой инкубации с колхицином, митотический индекс возрастал до 1,8±0,1%, что указывало на хорошую степень сохранности пролиферирующей фракции клеток.

В заключение, наши результаты показывают сохранение и даже усиление энергетической активности ККМ, выявленное с помощью потенциал-чувствительного зонда и хорошую выживаемость фракции пролиферирующих клеток при жестких условиях инкубации. В дальнейшем следует провести исследования соответствующих механизмов сохранения клеток костного мозга и их энергетического баланса в данных условиях хранения.

Ключевые слова

среда для хранения, выживаемость клеток, энергетический потенциал, митотическая активность, потенциал-чувствительный зонд, клетки костного мозга