GC-03. Перспективы применения полиэлектролитных нанокапсул в подходах генной терапии
Татьяна В. Машель1,2,3, Анастасия С. Букреева3, Анна С. Рогова3, Екатерина Е. Стефановская3, Алексей А. Пельтек2, Михаил А. Трофимов4, Яна В. Тараканчикова3,4, Кирилл В. Лепик1, Михаил В. Зюзин2, Александр С. Тимин1,3,5, Альберт Р. Муслимов1,3,4
1 НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
2 Национальный исследовательский университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия
3 Санкт-Петербургский Политехнический Университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия
4 Санкт-Петербургский национальный исследовательский Академический Университет, Санкт-Петербург, Россия
5 Томский Национальный Исследовательский Политехнический Университет, Томск, Россия
Резюме
Введение
Генная терапия на данный момент является одним из перспективных методов лечения инфекционных, онкологических, а также ряда наследственных заболеваний. В последнее время данный метод получил новое развитие в связи с открытием инструментов редактирования генома, которые имеют колоссальный потенциал применения в связи с высокой специфичностью. Выделяют два основных подхода к применению данной технологии: in vivo, т.е. введение конструктов непосредственно в организм больного, и ex vivo – лечение путем введения предварительно изолированных и культивируемых клеток донора или самого пациента. Ключевым ограничением для широкого внедрения данной технологии в клиническую практику является проблема эффективной и безопасной доставки генетических конструктов внутрь релевантных клеток. Вирусные методы доставки уже используются в медицинской практике, однако имеют ряд ограничений: мутагенез и воспалительный ответ, а также необходимость соблюдения особых технических требований производства, обуславливающих высокую стоимость конечного продукта. Одним из перспективных носителей для безопасной и эффективной доставки биологически активных соединений являются полиэлектролитные нанокапсулы, полученные путём послойного нанесения биодеградируемых полимерных слоёв на ядро из карбоната кальция с предварительно иммобилизированным на него доставляемым компонентом. По сравнению с другими способами доставки, этот метод дает ряд преимуществ, таких как высокая загружающая способность, относительная дешевизна изготовления, простота регуляции размера получаемых частиц, низкая токсичность, а также возможность защиты переносимого материала от агрессивного воздействия биологических сред организма.
Целью данной работы являлось исследование эффективности применения полиэлектролитных капсул в качестве платформы для доставки генетического материала. Для этого были поставлены и решены следующие задачи:
1. оценка токсичности полиэлектролитных капсул;
2. оценка эффективности запаковки генетического материала в получаемые носители;
3. модификация полиэлектролитных капсул с целью увеличения эффективности трансфекции;
4. определение оптимальных условий трансфекции первичных макрофагов человека.
Материалы и методы
В работе были использованы капсулы, полученные путем нанесения разнозаряженных слоев полимеров Polyarginine/Dextran sulfate (PARG/DEXS) и Human serum albumin/Tannic acid (HSA/TA) по технологии Layer-by-Layer на ядра из карбоната кальция, полученные методом соосаждения водных растворов карбоната натрия и хлорида кальция. Размер и эффективность запаковки генетического материала в капсулы оценивались с помощью методик DLS и агарозного гель- электрофореза. В качестве доставляемых генетических конструктов были использованы: плазмидная ДНК и матричная РНК (мРНК), кодирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP). В работе были использованы клетки линий HEK293T и THP-1, а также первичные макрофаги человека, изолированные из образцов крови здоровых доноров. Эффективность трансфекции клеток оценивалась проточной цитофлуориметрией и сканирующей лазерной конфокальной микроскопией.
Результаты
В ходе исследований была разработана платформа для внутриклеточной доставки генетического материала в виде полиэлектролитных капсул размером 500-700 нм. Данные носители продемонстрировали низкую цитотоксичность (жизнеспособность более 90%) при использовании капсул в высоком соотношении с клетками (100:1). При оценке эффективности запаковки генетического материала была выявлена высокая способность капсул удерживать загружаемый генетический материал. Эксперименты с доставкой плазмидной ДНК в клетки линии HEK293T показали успешную трансфекцию более 70% клеток. Эффективность трансфекции клеток линии THP-1 и первичных макрофагов человека с помощью мРНК составила 60%.
Заключение
В ходе работы полиэлектролитные капсулы показали высокую эффективность доставки генетического материала в клетки in vitro, наряду с низкой токсичностью процедуры трансфекции. Следует отметить, что трансфекция посредством капсул является простой в исполнении процедурой, не требующей специального оборудования и сред. В дальнейшем планируется проведение экспериментов по доставке клинически релевантных генетических конструктов в клетки, сложно поддающиеся трансфекции, а также исследования возможности использования полиэлектролитных капсул для доставки генетического материала in vivo.
Благодарность
Исследование выполнено при финансовой поддержке РНФ в рамках научного проекта № 20-45-01012 между Россией и Бельгией. А. Р. Муслимов благодарит за поддержку Российский Фонд Фундаментальных Исследований, грант №19-015-00098.
Ключевые слова
Нанокапсулы, полиэлектролиты, трансфекция клеток, генная терапия.
