ISSN 1866-8836
Клеточная терапия и трансплантация

GC-02. Оптимизация условий редактирования генома в гемопоэтических стволовых клетках с помощью дизайнерских нуклеаз TALEN и CRISPR/Cas9

Кирилл В. Лепик1, Алена И. Шакирова1, Марина О. Попова1, Владислав С. Сергеев1, Альберт Р. Муслимов1, Борис Фезе2, Александр Д. Кулагин1

1 НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
2 Научный отдел клеточной и генной терапии, отдел трансплантации стволовых клеток, университетский медицинский центр Гамбург-Эппендорф, Гамбург, Германия

doi 10.18620/ctt-1866-8836-2020-9-3-1-152

Резюме

Введение

Генная терапия – перспективное направление лечения ряда наследственных и приобретенных заболеваний, считающихся в настоящее время неизлечимыми. Технология геномного редактирования позволяет достичь беспрецедентной безопасности внесения стойких изменений в желаемой локализации генома. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) – классическая мишень для терапевтической генетической модификации человеческих клеток ex vivo, с потенциалом достижения стойкой коррекции фенотипа при тяжелых комбинированных иммунодефицитах, гемоглобинопатиях, некоторых болезнях накопления (синдром Гурлера, адренолейкодистрофия) и социально значимых инфекциях, включая ВИЧ-инфекцию. Целью настоящей работы является отработка протокола и оптимизация условий редактирования генома первичных ГСК человека с использованием дизайнерских нуклеаз типа TALEN и CRISPR/Cas9 на примере гена CCR5.

Материалы и методы

Исследование выполнено в соответствии с декларацией Хельсинки. Все доноры биологического материала дали информированное добровольное согласие на участие в исследовании. ГСК были выделены из костного мозга здоровых доноров с помощью иммуномагнитной сепарации с использованием набора CD34 MicroBead kit (Miltenyi Biotec). In vitro транскрипция мРНК белков eGFP, а также TALEN и Cas9, осуществлялась с помощью системы T7-mScript Standard (Biozym). In vitro транскрипция специфичных к последовательности гена CCR5 гидовых РНК (гРНК) осуществлялась с помощью набора реагентов MEGAshortscript T7 Transcription Kit (Thermofisher). После преактивации ГСК осуществлялась трансфекция клеток мРНК eGFP, TALEN или смесью мРНК Cas9 с CCR5-специфичными гидовыми РНК с помощью электропоратора Gene Pulser Xcell (BioRad) с различными параметрами электропорации: варьировалось число (1 или 2) и характеристики импульса (диапазон напряжения 220-500 вольт, длительности импульса 5-10 мс). Выполнен анализ эффективности трансфекции посредством оценки числа GFP позитивных и жизнеспособных клеток с помощью метода проточной цитофлюориметрии. Эффективность редактирования оценивалась методами цифровой капельной ПЦР (Bio-Rad) или Surveyor nuclease (SN) assay (EnGen® Mutation Detection Kit, NEB).

Результаты

Степень обогащения популяции CD34+ ГСК после селекции составляла не менее 85% (85-98%). По данным оценки эффективности трансфекции ГСК при различных параметрах электропорации (220В/38мс, 220В/10мс, 2×220В/10мс, 300В/5мс, 2×300В/5мс, 300В/10мс, 500В/5мс, 500В/10мс) отмечалось изменение числа GFP+ CD34+ клеток в диапазоне от 35% до 80%, а также снижение числа жизнеспособных ГСК при увеличении напряжения от 90% (контроль), до 65% (500В/10 мс). При оптимальных параметрах электропорации (300В/10мс) число GFP+/жизнеспособных клеток составило 80%/87%. При оптимальных условиях трансфекции, по данным цифровой капельной ПЦР частота целевого нокаута после электропарации мРНК TALEN составила 42-49%. По данным SN assay частота целевого нокаута после электропорации мРНК Cas9/гРНК составила 33-39%. При оптимальных условиях трансфекции не было выявлено значимого изменения колониобразующей способности ГСК в исследованных образцах.

Заключение

Выполнена отработка протокола и оптимизированы условия трансфекции мРНК Cas9/гРНК и TALEN первичных гемопоэтических стволовых клеток человека. Полученные результаты могут быть использованы для разработки терапевтических подходов геномного редактирования.

Благодарность

К.В.Лепик благодарит за поддержку Российский Фонд Фундаментальных Исследований, грант №19-29-04025мк.

Ключевые слова

Редактирование генома, нуклеаза TALEN, CRISP/CAS9, гемопоэтические стволовые клетки.


Том 9, Номер 3
30.09.2020

Загрузить версию в PDF

doi 10.18620/ctt-1866-8836-2020-9-3-1-152

Возврат к списку