In vitro модифицирующий эффект эритропоэтина на лимфоциты тимуса: ингибиторный анализ

Резюме

Эритропоэтин (ЭПО) является физиологическим стимулятором эритропоэза. Одним из основных эффектов ЭПО является снижение частоты апоптоза эритроидных клеток-предшественниц в костном мозге. Эти свойства ЭПО широко применяются при лечении различных заболеваний системы крови, в том числе – после трансплантации стволовых клеток. Ранее было установлено, что ЭПО оказывает активирующее воздействие на Т-лимфоциты (ТЛЦ), сопровождающееся увеличением количества флуоресцирующих митохондрий в клетке (nm/c) и увеличением суммарного трансмембранного потенциала на плазматической (Δφp) и митохондриальных мембранах (Δφm). Однако остается неясным, какой именно мембранный потенциал реагирует на воздействие ЭПО: Δφm, или (и) Δφp. Для ответа на этот вопрос мы использовали специфические ингибиторы окислительного фосфорилирования. Цель настоящего исследования – оценка роли митохондриальных функций в воздействии ЭПО на лимфоциты тимуса.

Материалы и методы

Исследовалось влияние ЭПО (“Eprex”, Cilag) на флуоресценцию ТЛЦ крыс in vitro после краткосрочной инкубации и воздействия несколькими ингибиторами: динитрофенолом (ДНФ) – ингибитором дыхательной цепи и разобщителем окислительного фосфорилирования; пентахлорфенолом (ПХФ) – разобщителем окислительного фосфорилирования; дициклогексилкарбодиимидом (ДЦКД) – ингибитором мембрансвязанной части АТФ-азы митохондриальной мембраны с помощью зонда DSM [4-(p-диметиламиностирилил)-1-метил пиридиний], определяющего трансмембранный градиент электрического поля. ТЛЦ выделяли из тимусов по стандартной методике. Окрашенные ДСМ клетки исследовали на люминесцентном микроскопе («Люмам – Р 8», ЛОМО, Россия) с использованием термостатированного столика. В каждом препарате измеряли флуоресценцию 50-70 клеток и рассчитывали среднюю интенсивность флуоресценции ТЛЦ (F̃). В каждой флуоресцирующей клетке подсчитывали nm/c. Статистическую обработку данных экспериментов проводили по коэффициенту корреляции рангов Спирмена.

Результаты и обсуждение

В серии экспериментов с ТЛЦ зарегистрировано снижение nm/c и F̃ после инкубации со всеми использованными ингибиторами, причем степень и скорость снижения этих параметров зависела от типа ингибитора и длительности инкубации. Максимальное снижение энергетики ТЛЦ достигалось при инкубации с ДНФ, после которого ЭПО не восстанавливает F̃ и nm/c. После инкубации с ПХФ ЭПО восстанавливает ~20-23% nm/c и F̃. Реакция ТЛЦ на ДЦКД подтверждает важную роль АТФ-азы в поддержании мембранного митохондриального потенциала. После деэнергизации ТЛЦ под действием ДЦКД, ЭПО восстанавливает ~42% nm/c и ~38% F̃.

Заключение

ЭПО способен частично восстанавливать поляризацию мембран митохондрий в ТЛЦ, нарушенную в результате воздействия ингибитора АТФ-азы (ДЦКД).

Ключевые слова

Эритропоэтин, Т-лимфоциты, энергетическая активность, ингибиторы, потенциалчувствительный витальный флуоресцентный зонд-катион 4-(п-диметиламиностирил)-1-метилпиридиния (ДСМ).