AW-02. Разработка методики получения лентивирусного вектора третьего поколения для производства анти-CD19 CAR-T-клеточного препарата

Резюме

Клеточная терапия генетически модифицированными Т-клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR), достигла значительных успехов при лечении В-клеточных злокачественных новообразований, таких как B-лимфобластный лейкоз (В-ОЛЛ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) и неходжкинская лимфома (НХЛ). CAR, нацеленный на определенный антиген, представляет собой химерную молекулу, состоящую из доменов Т-клеточного рецепторного комплекса и слитого с ними внеклеточного антиген-распознающего домена, в качестве которого может выступать одноцепочечный фрагмент (scFv) моноклонального антитела. CAR Т клетки способны эффективно распознавать несущие антиген клетки и уничтожать их. В отличие от распознавания, опосредованного ТКР, распознавание антигена с помощью CAR не зависит от главного комплекса гистосовместимости (MHC). Лентивирусные векторы (LV) обладают рядом преимуществ по сравнению с другими векторами доставки генов, кодирующих CAR. Их потенциал для интеграции и долгосрочной экспрессии терапевтических генов делает их эффективным инструментом для разработки генной и клеточной терапии. Целью настоящей работы была оптимизация процесса разработки и получения CAR-Т-клеточного лекарственного препарата со специфичностью к антигену CD19, имеющего в качестве костимуляторного и сигнального доменов последовательности CD28 и CD3ζ, соответственно.

Материалы и методы

В качестве линии-продуцента лентивирусного вектора (CAR LV) использовали адгезивную линию клеток эмбриональной почки человека HEK293T и суспензионную линию Expi293F. Экспрессионную плазмиду котрансфецировали в клетки тремя упаковочными плазмидами (pLP1(gag/pol), pLP2 (rev) и pLP/VSV-G (оболочка VSV G) с использованием полиэтиленимина (PEI) или липидных комплексов (GenJect-39, ExpiFectamine Transfection Reagent). Для оценки функциональных титров CAR LV проводили трансдукцию клеточной линии Т лимфобластной лейкемии человека (Jurkat E6.1). Уровень трансдукции оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии методом окрашивания клеток рекомбинантным белком CD19 Fc, конъюгированным с красителем Alexa Fluor 647. Уровень экспансии первичных Т-клеток, активированных и трансдуцированных CAR LV, измеряли в культуральных планшетах и биореакторах G-Rex в течение 7-14 дней. Для оценки функциональной активности использовали в качестве мишеней клеточные линии, несущие на своей поверхности антиген CD19 (RS4;11, Raji, NALM6, K562-CD19⁺), с использованием в качестве контрольной клеточной линии K562-CD19^–.

Результаты

Показано, что разработанный протокол получения лентивирусного вектора позволяет нарабатывать лентивирусные частицы, экспрессирующие химерный антигенный рецептор, с инфекционным титром (6-32)×10⁶ единиц трансдукции (TU)/мл (со средним значением 19×10⁶ TU/мл). Такие титры позволяют эффективно трансдуцировать Т-клеточные линии (Jurkat E6.1) и первичные Т клетки здоровых доноров и пациентов лентивирусным вектором, несущим конструкт CAR, достигая высокого уровня интеграции гена в первичных Т-клетках (20-70% при MOI=10). Полученный CAR-T-клеточный продукт демонстрирует высокий уровень экспансии (до 18 раз в культуральных планшетах и до 28 раз на платформе G-Rex на 8-10 день), а также киллинговую и пролиферативную активность в функциональных тестах in vitro с использованием в качестве мишеней клеточных линий, несущих на своей поверхности антиген CD19 (Raji, NALM6, K562-CD19⁺).

Выводы

В результате оптимизации методики производства получен анти-CD19 CAR-T-клеточный продукт, демонстрирующий высокий уровень функциональной активности в тестах in vitro, что позволило запустить проведение доклинических исследований эффективности и безопасности анти-CD19 CAR T-клеточной терапии.

Ключевые слова

Иммунотерапия, химерный антигенный рецептор, лентивирусный вектор, CAR-T-клетки, анти-CD19 CAR-T, функциональная активность, клеточный продукт.