BS-08. Создание модели с повышенной экспрессией PD-L1 и Tim-3 на основе миелоидной клеточной линии человека для исследования активности низкомолекулярных ингибиторов сигнальных путей контрольных точек иммунного ответа
Дина А. Сеничкина1, Алена И. Шакирова1, Ольга С. Епифановская1, Иван Н. Гапоненко1, Екатерина В. Белоцерковская2, Анна Б. Малышечева2, Кирилл В. Лепик1, Иван С. Моисеев1
1 НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, Первый Санкт-Петербургский
государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
2 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
Резюме
Миелодиспластический синдром (МДС) высокого риска – это прогностически неблагоприятная группа клональных заболеваний кроветворной ткани с низкой общей выживаемостью, не превышающей двух лет на фоне существующих методов лечения и высоким риском трансформации в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Среди возможных мишеней для таргетной терапии МДС потенциалом обладают рецепторы и лиганды иммунных контрольных точек (ИКТ). Экспрессия ИКТ PD-1/PD-L1 и Tim-3/Gal-9 была показана при миелоидных новообразованиях, в том числе МДС, на клетках опухоли и иммунного микроокружения (Yang, X. et.al, 2002). Важно отметить, что в литературе описаны случаи возникновения экспрессии Tim-3 после неудачного лечения анти-PD1 антителами с потерей последнего маркера на поверхности иммунных/бластных клеток (Koyama, S. et al, 2016). Целью данного исследования было создание модели с повышенной экспрессией PD-L1 и Tim-3 на основе клеточной линии человека лейкемического генеза для исследования низкомолекулярных ингибиторов сигнальных путей ИКТ при миелоидных неоплазиях.
Материалы и методы
Первоначальное тестирование базального уровня экспрессии PD-L1 и Tim-3 проводили на клеточных линиях: THP-1, Caco2, A549, HL-60, OCI-AML-2, культивируемых в стандартных условиях. Линии, использованные в работе, были предоставлены Российской коллекцией клеточных культур ИНЦ РАН. Для индукции экспрессии рецепторов ИКТ использовали аптечные препараты: для PD-L1 – интерферон гамма (Ингарон, Россия), для Tim-3: липополисахариды (LPS) (Пирогенал, Россия). Анализ экспрессии маркеров производили методом проточной цитофлуориметрии при окрашивании клеток коктейлем моноклональных антител к TIM-3 (CD366-APC), и PD-L1 (CD274-PE-Cy7), а также витальным красителем DRAQ7.
Результаты
В ходе предварительного скрининга были получены данные об отсутствии экспрессии CD274 и CD366 на всех тестируемых линиях без дополнительной стимуляции. Индукция экспрессии PD-L1/TIM3 проводилась в условиях культивирования клеток с различными концентрациями (2,5-750 нг/мл) интерферона в течение 24 часов. При оптимальной концентрация 50 нг/мл увеличение поверхностной экспрессии PD-L1 наблюдалось в клетках THP-1 (до 80%) и OCI-OCI-AML-2 (до 30%) при высоких параметрах выживаемости. В клетках HL-60 эффекта экспрессии PD-L1 добиться не удалось. Инкубация в течение 2 часов клеток THP-1 в присутствии LPS (25 нг/мл-10 мкг/мл) способствовало увеличению экспрессии Tim3 до 6-8% без снижения показателей жизнеспособности (90 %). При этом при долгосрочном культивировании (4-24 часа) в том числе в присутствии интерферона гамма (50 нг/мл) уровни Tim-3 не отличались от контрольных образцов.
Выводы
В ходе исследования был успешно отработан метод индукции экспрессии PD-L1 опухолевыми клеточными линиями, подходящий для тестирования эффектов ингибирования сигнальных путей этого рецептора. Оптимальной для индукции экспрессии PD-L1 в 80% клеток оказалась концентрация интерферона гамма 50 нг/мл. Дальнейшее повышение концентрации индуктора PD-L1 не целесообразно, поскольку это может помешать идентифицировать соединения, оказывающие лишь умеренное влияние на экспрессию PD-L1 (Spangenberg et al., 2021). Индукция стабильной высокой экспрессии Tim-3 в клетках THP-1 требует дальнейшей оптимизации.
Ключевые слова
PD-L1, Tim-3, THP-1, иммунные контрольные точки, острый миелоидный лейкоз, миелодиспластический синдром, ингибиторы, ОМЛ, МДС.
