BS-05. Эффективность генетической модификации локуса CCR5 специфичной нуклеазой CCR5-Uco-hetTALEN в субфракции гемопоэтических стволовых клеток с потенциалом к долговременному восстановлению стабильного кроветворения

Резюме

Генная терапия на основе аутологичной трансплантации генетически модифицированных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) человека становится важной терапевтической опцией для многих заболеваний. Среди ГСК наиболее важной фракцией являются редкие самообновляющиеся длительно репопулирующие клетки (ДР-ГСК). Они составляют 0,1-1% от общей популяции CD34+ ГСК в костном мозге и характеризуются CD34+/CD90+ иммунофенотипом. Эти клетки обладают наибольшим потенциалом к приживлению и пожизненному восстановлению кроветворения, в том числе из генетически модифицированных клеток, что делает их рациональной мишенью для клинической генной терапии на основе ГСК. Ввиду биологических особенностей достижение высоких значений редактирования целевых локусов в этих клетках является трудной задачей. Поскольку исследование эффективности нокаута целевых мишеней в популяции ДР-ГСК является важной частью доклинических исследований при разработке клеточных геннотерапевтических продуктов на основе ГСК, целью настоящего исследования было определить таковую для гена CCR5 в ДР-ГСК при использовании программируемой нуклеазы CCR5-Uco-hetTALEN для генной терапии ВИЧ инфекции.

Материалы и методы

Образцы продуктов афереза с мобилизованными гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ) ГСК были получены от трех здоровых доноров. Селекцию CD34+ клеток проводили на LS-колонках для позитивной селекции (Milteniy Biotec) c использованием реагентов CD34 MicroBead Kit (Milteniy Biotec). Чистоту селекции и долю ДР-ГСК после селекции оценивали методом проточной цитофлуориметрии (ПЦ) по фенотипу CD34+/CD90+/CD45RA-/Draq7-. Перед процедурой трансфекции клетки культивировали в среде стандартного состава: StemSpan™ (Stem Cell Technologies) с добавлением цитокинов hTPO, hSCF, hFlt3-Ligand (Milteniy Biotec). Далее клетки электропорировали CCR5-Uco-hetTALEN в общей концентрации 25 мкг/мл и инкубировали 24 ч при 32ºC. После этого ГСК помещали в стандартные условия и культивировали в течение 5 суток. По истечении инкубации ДР-ГСК сортировали из части культивируемых клеток на приборе BD FACSAria™ III (BD Biosciences) по вышеуказанному фенотипу. ДНК выделяли с использованием набора ExtractDNA Blood & Cells (Евроген). Эффективность нокаута гена CCR5 оценивали с помощью цифровой капельной ПЦР (цкПЦР) по описанному ранее протоколу (Mock et al., 2015; Schwarze et al., 2021).

Результаты

По результатам ПЦ чистота CD34+ клеток после магнитной селекции варьировала от 80,4 до 93,9%. Содержание клеток с иммунофенотипом CD34+/CD90+/CD45RA- в образцах после сортировки составляло 97%. Согласно полученным данным цкЦПР, общая эффективность нокаута CCR5 в образцах ДР-ГСК составляла 42,05±5,15% (от 37,73% до 47,75%). В общей популяции СD34+ клеток она была несколько выше 51,46±7,32 (от 46,42% до 59,86%), хотя отличия не были статистически значимыми (р=0,2). Тоже касалось и данных об отношении коротких (NHEJ) геномных перестроек к крупным в данном локусе при сравнении профиля таких событий в популяциях ДР-ГСК и ГСК (p=0,2).

Обсуждение и выводы

Проведенное исследование показывает, что уровень нокаута целевой мишени в популяции ДР-ГСК статистически не отличается от такового в общей популяции редактируемых CD34+ клеток при использовании нуклеазы CCR5-Uco-hetTALEN. Стоит отметить, что в отношении генной терапии ВИЧ инфекции популяция ДР-ГСК представляет особый интерес, поскольку может являться оптимальным источником трансплантата в силу биологических особенностей.

Ключевые слова

Гемопоэтические стволовые клетки, длительно репопулирующие гемопоэтические стволовые клетки, редактирование генома, TALEN, CCR5.