BS-03. In vitro изучение функциональных и иммунофенотипических особенностей анти-CD19 CAR T-клеточных препаратов, полученных из Т-лимфоцитов здоровых доноров и пациентов с В-клеточными злокачественными новообразованиями

Резюме

Клеточная иммунотерапия с использованием Т-лимфоцитов с химерным антигенным рецептором (CAR) продемонстрировала высокую эффективность в лечении В-клеточных злокачественных новообразований, в частности, острого B-лимфобластного лейкоза (В-ОЛЛ) и диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ). CAR – это химерная молекула, состоящая из сигнальных доменов Т-клеточного рецепторного комплекса и слитого с ними внеклеточного антиген-распознающего домена, в качестве которого, как правило, выступает одноцепочечный фрагмент (scFv) моноклонального антитела. CAR-Т-клетки с высокой аффинностью могут распознавать и уничтожать несущие целевой антиген клетки. CAR T клеточная терапия может быть проведена как в аутологичном, так и в аллогенном формате. Нередко CAR-T-клетки производят из Т-лимфоцитов здорового донора, являющегося донором для предшествующей аллогенной трансплантации гемопоэточеских стволовых клеток (алло-ТГСК) пациенту. При этом известно, что на функциональность полученного клеточного продукта влияет изначальное качество Т-клеток, взятых для производства, соответственно, параметры продукта, полученного из Т-лимфоцитов здорового донора и пациентов могут существенно различаться. Целью настоящей работы было изучение функциональных и иммунофенотипических особенностей анти-CD19 CAR-T-клеточных препаратов второго поколения, полученных из клеток здоровых доноров и пациентов.

Материалы и методы

Исследование проводили с использованием образцов, полученных от 3 здоровых доноров, 3 пациентов с ДВККЛ и 5 пациентов с B-ОЛЛ. CAR-T-клеточный препарат получали с использованием сепарированных CD3+ клеток, активированных реагентом Enceed (Genscript) и трансдуцированных лентивирусным вектором третьего поколения, несущим последовательность анти-CD19 CAR. Уровень трансдукции CAR-T-клеток оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии методом окрашивания клеток рекомбинантным белком CD19-Fc, конъюгированным с красителем AF-647. Экспансию CAR-Т-клеток оценивали спустя 7-14 дней. Для оценки функциональной активности проводили цитотоксический тест в точках 0 и 24 часа с использованием в качестве клеток-мишеней линии, несущие на своей поверхности антиген CD19 (Raji, NALM6). Проверяли различные соотношения эффектор:таргет (E:T). Функциональную активность и иммунофенотип оценивали методом проточной цитофлуориметрии.

Результаты

Исследование показало, что уровень трансдукции анти-CD19 CAR-T, полученного из клеток здоровых доноров и пациентов, не различался и составлял 19-49% (медиана 40%). Уровень экспансии CAR-T-клеточного препарата измеряли на 8-10 день от начала эксперимента; он составил 11-28 раз (медиана 15 раз) для здоровых доноров, 15-18 раз (медиана 15,5 раз) для пациентов с ДВККЛ и 5-8 раз (медиана 7,5 раз) для пациентов с B-ОЛЛ. Результаты цитотоксического теста показали, что количество клеток-мишеней снижается при всех соотношениях; наиболее выраженный эффект наблюдается при соотношении E:T=5:1 независимо от источника клеток для производства CAR-T. Иммунофенотипирование CAR T клеточного продукта показало наличие различных популяций Т-клеток памяти в каждом из продуктов, при этом 22-65% CAR+ клеток составляли клетки центральной памяти.

Заключение

В ходе исследования были изучены цитотоксические и иммунофенотипические особенности анти-CD19 CAR-T, полученных из Т-лимфоцитов здоровых доноров и пациентов с В-клеточными злокачественными новообразованиями. Было показано отсутствие отличий в уровне трансдукции, в то же время, уровень экспансии был значительно ниже при использовании клеток пациентов с В-ОЛЛ. Иммунофенотипирование показало наличие во всех клеточных продуктах популяции CAR+ Т-клеток центральной памяти. Таким образом, для производства анти-CD19 CAR-T-клеток с использованием исследуемого лентивирусного вектора могут быть использованы Т-лимфоциты из любого из перечисленных источников.

Ключевые слова

Иммунотерапия, B-ОЛЛ, ДВККЛ, химерный антигенный рецептор, CAR-T-клетки, анти-CD19.