DT-05. Влияние мезенхимальных стволовых клеток плаценты на колониеобразующую способность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после депонирования

Резюме

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) плацентарного происхождения обладают способностью поддерживать гемопоэз, поскольку плацента является транзиторным органом кроветворения в эмбриогенезе. МСК, выделенные из разных анатомических частей плаценты, обладают различными морфо-функциональными особенностями. Пуповинная кровь (ПК) – один из источников гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), но низкое содержание ГСК ограничивает ее применение для взрослых пациентов. Использование фидерного слоя МСК рассматривается как перспективный метод для экспансии ГСК ПК in vitro. Целью исследования являлась оценка влияние МСК из разных анатомических частей плаценты и костного мозга (КМ) на колониеобразующую способность ГСК-ПК in vitro.

Материалы и методы

МСК были выделены из децидуальной ткани, ворсин хориона, амниотической мембраны послеродовой плаценты 5 доноров и образцов КМ 4 доноров и экспансированы in vitro. Подлинность МСК подтверждалась иммунофенотипическим методом проточной цитофлуориметрии по экспрессии характерных для МСК антигенов CD90, CD105, CD73. Образцы ПК (n=5) замораживали с применением 10% ДМСО и депонировали при температуре -196ºС в течение 24-29 месяцев. Мононуклеарные клетки ПК после размораживания в количестве 1×10⁶ помещали на лунки с предварительно облученным (доза 30 Гр) фидерным слоем МСК плаценты или МСК костного мозга (МСК-КМ) в соотношении 10:1. Клетки культивировали в среде RPMI, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки и ростовые факторы SCF, TPO, FLt-3l, IL-6 в течение 7 суток. Пролиферативную активность ГСК оценивали по способности клеток-предшественников гемопоэза к формированию колониеобразующих единиц (КОЕ) в среде метилцеллюлозы (StemCell Technologies, Канада) в течение 14 суток при температуре 37°С, 5% СО₂ и 90% влажности. Число КОЕ-ГМ, БОЕ-Э, КОЕ-ГЭММ подсчитывали под инвертированным микроскопом.

Результаты

Анализ колоний показал, что ГСК ПК после 7 суток культивирования как с МСК из разных частей плаценты, так и с МСК-КМ не отличались по способности к колониеобразованию, и во всех вариантах наблюдался прирост КОЕ в среднем в 1,8 раз по сравнению с 0-м днем (р<0,05), тогда как в отсутствии МСК число КОЕ увеличилось лишь в 1,1 раз. МСК из всех источников поддерживали пролиферацию предшественников гранулоцитов и макрофагов и первоначальное количество КОЕ-ГМ 16 (4-20) увеличилось после культивирования с МСК из децидуальной ткани до 64 (40-72), ворсин хориона – до 44 (10-112), амниотической мембраны – до 72 (36-88), МСК-КМ до 36 (20-72) (p<0,05). Важно отметить, что и МСК-КМ, и МСК плаценты способствовали сохранению субпопуляции ранних предшественников миелопоэза: число КОЕ-ГЭММ до экспансии составляло 6 (4-12), а после культивирования с МСК-КМ – 8 (0-16) и МСК плаценты – 5 (0-16). Присутствие МСК приводило к изменению соотношения типов КОЕ: до экспансии доля КОЕ-ГМ составляла 71%, БОЕ-Э – 25% и КОЕ-ГЭММ – 4%, тогда как после культивирования с МСК децидуальной ткани и амниона доля БОЕ-Э снижалась до 12% и 11%, а КОЕ-ГМ увеличивалась соответственно (р<0,05).

Выводы

Применение МСК из разных частей плаценты и костного мозга для экспансии ГСК in vitro в образцах депонированной при сверхнизкой температуре пуповинной крови позволяет увеличить число бипотентных клеток-предшественниц гемопоэза КОЕ-ГМ, а также сохранить уровень ранних мультипотентных клеток-предшественниц миелопоэза КОЕ-ГЭММ.

Ключевые слова

Мезенхимальные стволовые клетки, пуповинная кровь, плацента, колониеобразующая единица.