GC-03. Повышение уровня трансфекции при доставке генетического материала полимерными носителями комплексного состава
Анастасия С. Букреева1, Анна С. Рогова1, Татьяна В. Машель3, Дарья Р. Ахметова1, Александр С. Тимин1,2, Альберт Р. Муслимов1,2
1 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия
2 Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
3 Университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия
Резюме
В настоящее время генная терапия является перспективным направлением для лечения широкого спектра заболеваний. Основным ограничением для развития генной терапии является проблема эффективной доставки генетического материала, так как использование «голых» нуклеиновых кислот не дает желаемого результата. Полимерные носители защищают генетический материал во время транспортировки к клеткам-мишеням, однако необходимо также защитить его и после попаданию в клетку. Фоновая активность нуклеаз считается значительным препятствием для эффективной доставки генов с использованием невирусных векторов. Для решения данной проблемы необходимо подобрать ингибитор, защищающий генетический материал от деградации и положительно влияющий на эффективность трансфекции. Целью данной работы является оценка эффективности пептидного ингибитора ДНКаз II (SLRLLQWFLWAC) на увеличение уровня трансфекции клеток млекопитающих.
Материалы и методы
В работе были использованы полиэлектролитные носители, полученные нанесением по технологии Layer-by-Layer слоев разнозаряженных полимеров (Polyarginine/Dextran sulfate) на ядра из карбоната кальция, предварительно полученные путем соосаждения водных растворов солей карбоната натрия и хлорида кальция. Модельным генетическим материалом являлась плазмидная ДНК, кодирующая зеленый флуоресцентный белок. Были рассмотрены варианты инкапсуляции пДНК в ядро, между полимерными слоями и одновременная запаковка в ядро и в слой. Пептидный ингибитор добавляли к пДНК в соотношении 1:1. Эксперименты ставились на клеточной культуре НЕК 293. Были рассмотрены разные способы засева частиц к клеткам: их добавляли либо к уже адгезированным клеткам, либо частицы предварительно инкубировали с клетками, после чего их засевали на культуральных пластик. Было изучено влияние добавления эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) на эффективность трансфекции. Частицы добавлялись к клеткам в соотношении 100:1. Эффективность трансфекции оценивалась качественно на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе и количественно при помощи проточной цитометрии.
Результаты
Анализ результатов экспериментов показал, что использование пептидного ингибитора ДНКазы II значительно повышает эффективность трансфекции. Наилучший результат был получен при включении генетического материала одновременно в ядро, и в качестве слоя полимерной частицы. Было выявлено, что добавление частиц к адгезированным клеткам, а также использование среды, не содержащей FBS, положительно влияет на уровень трансфекции.
Выводы
В результате работы было исследовано влияние пептидного ингибитора ДНКазы II на эффективность трансфекции, а также выявлены оптимальные условия засева частиц, содержащих генетический материал, к клеткам млекопитающих.
Благодарность
Работа выполнена при поддержке проекта Российского Научного Фонда 19-75-10010.
Ключевые слова
Генная терапия, ингибитор ДНКаз, эффективность трансфекции.