ISSN 1866-8836
Клеточная терапия и трансплантация

Изменить отображение страницы на: только анонсы

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-11. Осложнения после терапии Т-лимфоцитами с химерным антигенным рецептором у взрослых

Антонина Е. Щекина, Геннадий М. Галстян, Ольга А. Гаврилина, Залина Т. Фидарова, Вера В. Троицкая, Вера А. Васильева, Елена Н. Паровичникова, Михаил А. Масчан

GC-12. Комбинируя CAR-T и биспецифические антитела: новый дизайн химерного антигенного рецептора с внеклеточным доменом CD3E для перенаправления противоопухолевой специфичности с помощью биспецифических антител

Даниил И. Шмидт1, Иван Н. Гапоненко1, Никита Д. Ёлшин2, Ольга С. Епифановская1, Татьяна Н. Беловежец3, Андрей А. Горчаков3, Сергей В. Кулемзин3, Андрей М. Чекалов1, Елена В. Бабенко1, Альберт Р. Муслимов1, Владислав С. Сергеев1, Кирилл В. Лепик1, Александр Д. Кулагин1

GC-13. Сравнительная оценка условий криоконсервации клеточных культур K562 и мезенхимальных стромальных клеток

Ирина А. Сидорова, Кирилл В. Лепик, Альберт Р. Муслимов, М. А. Трофимов, Ольга С. Епифановская, Владислав С. Сергеев, Александр Д. Кулагин

GC-15. Изучение свойств полимерных микрокапсул, синтезированных с помощью метода «мягкой литографии» для запаковки генетических конструкций

Анастасия А. Якубова1,2, Павел М. Тальянов3, Михаил В. Зюзин3, Альберт Р. Муслимов1,2, Александр С. Тимин1

GC-14. СаСО3 ватериты, покрытые декстрансульфатом, как системы для регионарного введения доксорубицина

Наталья Н. Сударева1,2, Ольга М. Суворова1, Дмитрий Н. Суслов3, Олег В. Галибин2, Александр Д. Вилесов1,2

GC-09. Тестирование малых молекул для стимуляции процесса гомологичной репарации концов двуцепочечных разрывов ДНК в локусе CCR5 при трансфекции гемопоэтических стволовых клеток человека мРНК CCR5-Uco-TALEN

Алена И. Шакирова1, Кирилл В. Лепик1, Альберт Р. Муслимов1, Владислав С. Сергеев1, Т. Р. Карпов1, К. И. Аношкин2, Марина О. Попова1, Борис Фезе1,3, Александр Д. Кулагин1

GC-08. Изучение биораспределения полимерных носителей для дальнейшего использования в генной терапии

Анна С. Рогова1, Анастасия С. Букреева1, Алиса С. Постовалова1, Дарья Р. Ахметова1, Александр С. Тимин1,2, Альберт Р. Муслимов1,2

GC-03. Повышение уровня трансфекции при доставке генетического материала полимерными носителями комплексного состава

Анастасия С. Букреева1, Анна С. Рогова1, Татьяна В. Машель3, Дарья Р. Ахметова1, Александр С. Тимин1,2, Альберт Р. Муслимов1,2

GC-02. Доклинические исследования СD20-специфического Car-T клеточного препарата

Татьяна Н. Беловежец, Андрей А. Горчаков, Сергей В. Кулемзин

GC-04. Создание in vivo модели терапии рака простаты для исследования противоопухолевого потенциала онколитических вирусов в сочетании с CAR T-клеточной иммунотерапией

Антон Н. Чикаев1, Сергей В. Кулемзин1, Ольга Ю. Волкова1, Татьяна Н. Беловежец1, Анастасия В. Семенова2, Сергей С. Зайнутдинов2, Антонина А. Гражданцева2, Галина В. Кочнева2

GC-07. Лечение онкологических заболеваний микроносителями с использованием комбинированной терапии

Алиса С. Постовалова1, Тимофей Е. Карпов1, Дарья Р. Ахметова1, Альберт Р. Муслимов2, Александр С. Тимин1, Михаил В. Зюзин3

GC-06. Модификация наноносителей оксида кремния металлическими оболочками с целью удержания 225AC и его дочерних изотопов

Тимофей Е. Карпов, Михаил В. Зюзин, Александр С. Тимин, Дмитрий О. Антуганов, Альберт Р. Муслимов

GC-01. Разработка методов модификации нано- и микроносителей для in vitro и in vivo визуализации

Дарья Р. Ахметова1, Тимофей Е. Карпов1, Алиса С. Постовалова1, Альберт Р. Муслимов2, Александр С. Тимин1, Михаил В. Зюзин3

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-11. Осложнения после терапии Т-лимфоцитами с химерным антигенным рецептором у взрослых

Загрузить версию в PDF

Антонина Е. Щекина, Геннадий М. Галстян, Ольга А. Гаврилина, Залина Т. Фидарова, Вера В. Троицкая, Вера А. Васильева, Елена Н. Паровичникова, Михаил А. Масчан

Национальный медицинский исследовательский центр гематологии, Москва, Россия

Терапия T-лимфоцитами с химерным антигенным рецептором (CAR-T-терапия) является высокоэффективным методом лечения рефрактерных к химиотерапии В-клеточных лимфом и острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ). Однако CAR-T-терапия может сопровождаться развитием тяжелых, угрожающих жизни осложнений, среди которых наиболее серьезные – синдром выброса цитокинов (СВЦ) и c иммунными клетками ассоциированный нейротоксический синдром (ИКАНС). Цель работы – установить характер, частоту развития и методы лечения осложнений CAR-T-терапии у взрослых больных.

Материалы и методы

В проспективный анализ включено 9 процедур CAR-T-терапии, которые были проведены у 5 больных (3 женщины, 2 мужчины) В-клеточными лимфомами и В-ОЛЛ в возрасте от 19 до 38 лет (медиана – 29 лет). 1 больному с рецидивом В-ОЛЛ выполнено 4 процедуры CAR-T-терапии, у 1 больной с рефрактерной диффузной В-крупноклеточной лимфомой – 2 процедуры. У 3 больных с экстрамедуллярными рецидивами В-ОЛЛ (у 1 больного – нейрорецидив) процедуры CAR-T-терапии выполнялась однократно. Доза и вид CAR-T-терапии определялись индивидуально. Все больные перед CAR-T-терапией получали тоцилизумаб и наблюдались в отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ). Регистрировали сроки возникновения осложнений, виды осложнений на основании принятых критериев1, эффективность проводимого лечения осложнений CAR-T-терапии.

Результаты

СВЦ развился в 4 из 9 процедур CAR-T-терапии. Частота развития тяжелого СВЦ (≥3 степени) составила 25%. У всех больных с СВЦ была лихорадка > 39ºС. Артериальная гипотензия была в 3 из 4 случаев СВЦ. В 1 случае развился шок с полиорганной дисфункцией, для лечения которого применялась вазопрессорная терапия, экстракорпоральная сорбция цитокинов, гемодиафильтрация. Гипоксемия зарегистрирована в 2 из 4 случаев, ни в одном из них не потребовалось проведения искусственной вентиляции легких. Медиана времени развития СВЦ составила +6,5 день (4-7 дни) после трансфузии CAR-T-клеток, медиана продолжительности СВЦ – 4,5 дня (2-5 дней). Тоцилизумаб (8 мг/кг) применяли в 2 случаях СВЦ в виде однократных введений. В 8 из 9 случаев CAR-T-терапии наблюдалась гипофибриногенемия (медиана 1,2 г/л, разброс 0,8-1,9 г/л). В 6 из 9 случаев отмечена гипонатриемия (медиана 124 ммоль/л, разброс 122-132 ммоль/л). У 1 больного с нейролейкемией на +7 сутки развился ИКАНС 3 степени тяжести. Цитоз ликвора составил 77 клеток/мл, при иммунофенотировании в ликворе обнаружены CAR-T-клетки. Проводилась терапия дексаметазоном (20 мг/м2/сут.), реверсия ИКАНС наблюдалась в течение 24 ч после начала терапии дексаметазоном. В 2 из 9 случаев развился синдром лизиса опухоли, в 1 случае развился септический шок, явившийся причиной смерти больного. Общая выживаемость после CAR-T-терапии составила 89%.

Выводы

В 55% случаев после CAR-T-терапии могут развиваться серьезные осложнения (СВЦ, ИКАНС, септический шок), требующие интенсивной дифференциальной диагностики и лечения.

Ключевые слова

CAR-Т-терапия, синдром высвобождения цитокинов, синдром нейротоксичности.

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-10. Биоинформатический анализ онкогена RAD54L для выявления влияния на возникновение гемопоэтических стволовых нарушений

Загрузить версию в PDF

Богдан О. Щеглов                                                

Школа медицины, Дальневосточный федеральный университет, Владивосток, Россия

В ряде исследований была продемонстрирована АТФ-зависимая активность гемопоэтических стволовых клеток из иммуноочищенного меченого маркера элюата RecQL1 на примере человеческого гена RAD54L. Также в браузере генома UCSC представлено множество публикаций, связанных с мутантной активностью гена, что указывает на биомедицинский потенциал изучения этого гена.

Материалы и методы

Данные были собраны и сохранены в геномном браузере UCSC. Для рассматриваемого гена большинство совпадений с мРНК человека были обнаружены в базах данных NCBI RefSeq, UCSC и GENCODE. Соотношение большинства интронов и экзон (только исходные имеют разную длину), их длина соответствует мРНК человека и аннотации экспрессированному тэгу последовательности (EST) человека. При рассмотрении гена RAD54L с различными аннотациями в RefSeq невозможно дать точную оценку сравнения с экспериментальными и прогнозируемыми РНК с концом PolyA (таких РНК нет). Согласно гену RAD54L, при секвенировании в клеточной культуре K562 PolyA+ преобладает множество псевдогенов. Большая часть транскрипта находится в цитозоле и нуклеосоме. Уровень экспрессии для CAGE в большей степени наблюдается в нуклеосоме и цитозоле.

Результаты

Результаты показали, что этот ген в аннотациях был достаточно точно рассчитан и интерпретирован. Для гена RAD54L наблюдается большое количество пептидов, высокий уровень рибосомных сигналов профилирования, которые совпадают со структурой экзона гена, поэтому он является геном, кодирующим белок. По данным базы данных COSMIC, были выявлены множественные мутации, которые соответствуют всем экзонам гена при заболеваниях гемопоэза, эндометрия и опухолей легких. Аденокарцинома, толстая кишка, соматика, лимфома, неходжкинский рак, рак молочной железы, патологии стволовых клеток были обнаружены в базе данных OMIM.

Заключение

Исходя из полученных результатов, можно утверждать, что данный ген RAD54L кодирует белок, который является важным звеном во многих физиологических, функциональных и патологических процессах в организме человека. Мутационная активность этого гена с высокой вероятностью приводит к развитию патологий различного генеза: анализ показал влияние на онкогенный процесс, развитие соматических заболеваний. Он играет большую роль в развитии наследственных заболеваний. Более того, имеется достаточное количество публикаций по исследованиям рассматриваемого гена, что указывает на возможные перспективные исследования биомедицины в части профилактики и лечения соматических и онкогенных заболеваний человека.

Ключевые слова

Биоинформатический анализ, гемопоэтические стволовые клетки, ген RAD54L.

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-12. Комбинируя CAR-T и биспецифические антитела: новый дизайн химерного антигенного рецептора с внеклеточным доменом CD3E для перенаправления противоопухолевой специфичности с помощью биспецифических антител

Загрузить версию в PDF

Даниил И. Шмидт1, Иван Н. Гапоненко1, Никита Д. Ёлшин2, Ольга С. Епифановская1, Татьяна Н. Беловежец3, Андрей А. Горчаков3, Сергей В. Кулемзин3, Андрей М. Чекалов1, Елена В. Бабенко1, Альберт Р. Муслимов1, Владислав С. Сергеев1, Кирилл В. Лепик1, Александр Д. Кулагин1

1 НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
2 НИИ Гриппа им. А.А. Смородинцева, Санкт-Петербург, Россия
3 Институт молекулярной и клеточной биологии, СО РАН, Новосибирск, Россия

Т-клеточная терапия с использованием рекомбинантного химерного антигенного рецептора (CAR-T) стала выдающийся терапевтической опцией для лечения некоторых В-клеточных злокачественных новообразований. Однако, примерно у половины пациентов наблюдаются рецидивы. Важным механизмом устойчивости к CAR-T терапии являются уменьшение экспрессии антигена и истощение CAR-T продукта. Большинство биспецифических Т-клеточных антител (BsAbs) связывают белок CD3-эпсилон (CD3ε) на Т-клетках вместе с ассоциированным с опухолью антигеном. Использование CD3ε в качестве внеклеточного домена CAR позволяет задействовать данный рецептор в формировании иммунных синапсов как при взаимодейстии BsAbs с Т-клеточным рецептором. CAR-T-терапия обладает непренебрежимой токсичностью – вплоть до фатальных исходов у некоторых пациентов. Наш подход потенциально нацелен на снижение токсического воздействия CAR-T путем контроля путем контроля инфузии BsAbs, а подбор специфичности возможен путем изменения BsAbs. Кроме того, возможность переведения CAR-T клеток в неактивное состояние путем прекращения инфузии BsAbs предположительно устраняет истощение клеточного продукта [1].

Материалы и методы

кДНК внеклеточного домена (ВКД) гена CD3E была получена из мРНК мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) здорового донора и клонирована в pIRES. Затем кДНК внеклеточный домен CD3E была вставлена в лентивирусную плазмиду pCDH, содержащую FMC63-CD8stalk-41bbz CAR с NGFR в качестве репортерного гена заменяя FMC63 (клон 7). Лентивирусные препараты получали с использованием клеток HEK293T и упаковывающих плазмид pMD2.G и psPAX2. Лентивирусный препарат титровали с использованием линии клеток HEK293. PBMC здорового донора выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Клетки были посажены в лунку в концентрации 1-2*106 клеток/мл и активированы 0,1 мкг/мл anti-CD3 антителами (OKT3) с добавлением 50 ЕД/мл IL-2 в течение 3 дней. На 3-й день клетки были трансдуцированы лентивирусным вектором в течение 2 дней. На 5-8 день после активации с помощью проточной цитометрии клетки оценивали на экспрессию NGFR. На следующий день после определения процента NGFR-положительных клеток проводили тест на цитотоксичность: клеточную линию Raji, окрашенную CFSE, инкубировали с CAR-T-клетками в различных соотношениях в двух повторах с добавлением в различных концентрациях BsAbs (блинатумомаб или глофитамаб). Процент выживших клеток-мишеней (Raji) определяли методом проточной цитометрии через 4 или 24 часа. Цитотоксичность определяли по формуле: 100 – живые клетки/контрольные клетки живые (без эффекторов).

Результаты

Титр лентивируса составил 8×104/µL на клетках HEK293T. Эффективность трансдукции составила 30-90%. Цитотоксичность при инкубации 4 и 24 часа с блинатумомабом в концентрациях 0, 10, 100 и 200 нг/мл при соотношении эффектор:мишень (Э:М) – 0,3:1, 1:1, 3:1, 5:1 статистически значимо не отличалась от контроля. Цитотоксичность глофитамаба тестировали при концентрациях 0, 1, 10 пМ/л с соотношением (Э:М) 0,3: 1, 1: 1, 5: 1 в течение 24 часов. Наибольшая цитотоксичность была в соотношении (Э:М) 5:1, где CAR-T был более эффективным, чем нетрансдуцированные Т-клетки при концентрации глофитамаба 1 пМ/л (59% против 93%) и 10 пМ/л (74% против 96%).

Вывод

Новые CAR с внеклеточным доменом CD3E, перенаправляемые BsAbs (глофитамабом), активны против В-клеточной лимфомы in vitro, но при применении блинатумомаба подобного не замечено, что можно объяснить тем, что фрагмент OKT3, на котором основан блинатумомаб, распознает CD3ε только в качестве димера, но не мономера [2-4]. Следовательно, является оправданным создание CAR с внеклеточными доменами CD3epsilon/CD3gamma и CD3epsilon/CD3delta.

Ключевые слова

CAR-T, химерный антигенный рецептор, клеточная терапия, В-клеточные опухоли, биспецифические антитела.

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-13. Сравнительная оценка условий криоконсервации клеточных культур K562 и мезенхимальных стромальных клеток

Загрузить версию в PDF

Ирина А. Сидорова, Кирилл В. Лепик, Альберт Р. Муслимов, М. А. Трофимов, Ольга С. Епифановская, Владислав С. Сергеев, Александр Д. Кулагин

НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия

Криоконсервация клеточного материала является необходимым этапом при ведении клеточных линий, а так же при создании биомедицинских клеточных продуктов (БМКП). В настоящее время актуальной задачей является устранение компонентов ксеногенного происхождения из сред для криоконсервации клеток, входящих в состав БМКП. Целью данного исследования является сравнение различных параметров криоконсервации культур и влияние их на жизнеспособность и пролиферативную активность клеток.

Материалы и методы

Исследование проводилось на клеточных линии К 562 и культуре первичных мезенхимальных стромальных клеток мыши (mMSC). В исследование включены 5 групп, различающихся по составу среды для криоконсервации: a) стандартные условия – полная среда (RPMI/®-MEM+10% FBS)+10%DMSO с использованием криоконтейнера (Mr. Frosty, Nalgene, США), б) полная среда+10%DMSO без использования криоконтейнера, в) коммерчески доступная среда CryoStor® CS10 (Stem Cell Technologies, США), г) раствор SSP+ (MacoPharma, Франция) с 10% DMSO, д) негативный контроль полная среда без добавления DMSO. Каждый образец из группы исследовался в трех повторах, подвергался заморозке в течении 7 дней при температуре -80°С, в трех независимых экспериментах. После разморозки производилась оценка жизнеспособности клеток методом проточной цитофлуориметрии с добавлением витального красителя 7AAD. Проведен анализ динамики пролиферативной активности образца клеток числом 1×10^4 в исследуемых группах спектрофотометрическим методом с использованием витального красителя alamar blue через 24, 72 и 168 ч. Статистическое сравнение групп проводилось методом Мана-Уитни.

Результаты

При оценке жизнеспособности клеточной линии К562 после разморозки, медиана доли 7-AAD+ клеток составила в группе а) 1,5% (1,2-2,1), группе б) 1,6% (1,1-1,8) группе в) 1,4% (1,2-1,9), группе г) 1,4% (1,1-1,8), группе д) 4,5% (2,7-5,6). При сравнении показателей жизнеспособности не было выявлено различий между условиями а, б, в, г. Перечисленные условия обладали статистически значимым преимуществом по сравнению с негативным контролем (д) (p=0,02). При оценке жизнеспособности клеток mMSC медиана доли 7-AAD+ клеток составила в группе а) 43,8% (16-62), б) 46,0% (22-65), в) 30,2% (17-46), г) 19,7% (16-26), д) 90,1% (86-97). При сравнении выявлено статистически значимое преимущество условий а, б, в, г по сравнению с контролем д (p<0,001). Выявлено преимущество среды на основе SSP+ по сравнению с остальными условиями консервации (p<0,05). При оценке пролиферативной активности клеточной линии К562 отмечалось увеличение медианы значения интенсивности флюоресценции резоруфина через 168 ч. по сравнению со значением через 24 часов в группе а) на 39% б) на 61% в) на 67% г) на 44% д) на 23%. Все условия консервации обладали преимуществом по сравнению с группой негативного контроля (p<0,0001). Показатель флюоресценции был значимо выше в группе Cryostor по сравнению со стандартными условиями (полная среда+DMSO).

Вывод

Проведенный анализ демонстрирует отсутствие преимуществ использования криоконтейнера при заморозке исследованных клеточных типов. Криоконсервация с использованием среды Cryostor CS10 и SSP+ c добавлением DMSO продемонстрировали наибольший потенциал в отношении сохранения жизнеспособности и пролиферативной активности исследованных культур.

Ключевые слова

Криоконсервация, клеточные культуры, клеточные продукты, ДМСО.

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-15. Изучение свойств полимерных микрокапсул, синтезированных с помощью метода «мягкой литографии» для запаковки генетических конструкций

Загрузить версию в PDF

Анастасия А. Якубова1,2, Павел М. Тальянов3, Михаил В. Зюзин3, Альберт Р. Муслимов1,2, Александр С. Тимин1

1 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский национальный исследовательский Академический университет имени Ж. И. Алферова Российской академии наук, Санкт-Петербург, Россия
3 Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики, Санкт-Петербург, Россия

Для эффективной доставки генетического материала в клетки, необходимо обеспечить благоприятные условия проведения трансфекции, защитить его от внутриклеточного микроокружения, pH среды, ферментов. Это реализуемо при запаковке его в микроносители новым методом – «мягкая литография», позволяющая «отпечатывать» на мягкой силиконовой подложке с определенной микроструктурой полимерные микрокапсулы заданной величины и формы. Этот способ минует такие нежелательные стадии производства полиэлектролитных микрокапсул как: образование ядра, нанесение полимеров на поверхность ядра и последующее его удаление. Процесс производства становится более контролируемым и эффективным, при этом запаковка веществ и среды в микрокапсулы не зависит от сродства веществ к ядру, заряда носителя. В процессе исследования были успешно запакованы гидрофобные и гидрофильные структуры от 10 нм до 5 мкм, являющиеся неустойчивыми в условиях окружающей среды. Был проведен синтез стерильных микрокапсул. Цель исследования: оценить стабильность микрокапсул, токсичность для живых сред и способность удерживать материал в течении определенного времени.

Материалы и методы

Использовали силиконовую подложку для синтеза микрокапсул. Стабильность изучалась на конфокальном микроскопе, спектрофлюориметре. Полимеры: полилактид (ПЛА), поликапролактон (ПКЛ), полиметилметакрилат (ПММА). Среды, в которых исследовалась стабильность: вода, натрий-фосфатный буфер, сыворотка крови. Токсичность определялась in vitro на клетках СТ-26.

Результаты

Полимерные микрокапсулы не являются токсичными для клеток. Данные носители продемонстрировали высокую удерживающую способность, сохраняя свойства инкапсулированных биологически активных соединений в течение длительного периода времени (>7 дней).

Выводы

Таким образом, производство микрокапсул методом «мягкой литографии» может быть эффективным для инкапсулирования генетического материала с сохранением его биологической активности.

Благодарность

Работа выполнена при поддержке Российского Научного Фонда (грант № 20-45-01012).

Ключевые слова

Микрокапсулы, доставка, литография, генетический материал, полимеры, носители.

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-14. СаСО3 ватериты, покрытые декстрансульфатом, как системы для регионарного введения доксорубицина

Загрузить версию в PDF

Наталья Н. Сударева1,2, Ольга М. Суворова1, Дмитрий Н. Суслов3, Олег В. Галибин2, Александр Д. Вилесов1,2

1 Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
3 Российский научный центр радиологии и хирургических технологий им. акад. А. М. Гранова, Санкт-Петербург, Россия

Доксорубицин (ДОХ) – водорастворимый антрациклиновый антибиотик, обладающий высокой противораковой эффективностью. Уменьшения концентрации ДОХ в крови ниже кардиотоксического уровня в процессе терапии можно добиться, формируя депо, содержащее системы доставки ДОХ с пролонгированным высвобождением лекарства. Для этих целей использовали кальций карбонатные пористые ватериты, допированные полианионом декстран сульфатом (ДекС). Субмикронные размеры носителей не позволяют свободно включаться им в кровеносное русло. Распространяется токсическое лекарство по организму только после попадания в кровь в результате высвобождения из систем доставки (СД). Внутрибрюшинное введение крысам с перевитой гепатомой Зайделя ДОХ-содержащих систем доставки позволило оценить эффективную концентрацию ДОХ, тормозящую рост опухоли и уменьшающую объем асцитной жидкости.

Методы и результаты

Динамику поступления ДОХ в кровь здоровых крыс после внутрибрюшинного введения ДОХ в СД состоящих из пористых СаСО3 ядер, покрытых ДекС, определяли при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Реакцию экспериментальных крыс с перевитой гепатомой Зайделя контролировали на основании результатов физикального осмотра и аутопсии крыс в течение 21 дня после введения СД. Показано, что внутрибрюшное введение в крыс с привитой гепатомой Зайделя 2 мг ДОХ в системе доставки на базе допированных декстрансульфатом пористых кальций карбонатных ядер увеличивает в 1,75 раз продолжительность жизни и вдвое уменьшает объем асцита у экспериментальных животных. Более эффективного подавления опухоли можно ожидать, увеличивая дозу ДОХ до 4 мг на животное. Динамику появления ДОХ в плазме крови после внутрибрюшинного введения здоровым крысам лекарства в СД сравнивали с динамикой свободного ДОХ, который через 2 дня после введения крысам исчезает из плазмы крови. Как видно из рис. 1, использование СД позволяет продлевать присутствие лекарства в крови. Пористые карбонатные ядра, покрытые декстрансульфатом, высвобождают ДОХ в течение 2 недель в концентрациях, ниже кардиотоксичной.

Выводы

При использовании систем доставки ДОХ на базе кальций карбонатных пористых ядер, покрытых декстрансульфатом, негативных реакций у крыс не обнаружено, что подтверждено поведением и физическим состоянием подопытных животных, а также результатами аутопсии. Следовательно, исследованные системы доставки могут быть использованы для пролонгированной регионарной доставки противоопухолевого препарата ДОХ.

Ключевые слова

Доксорубицин, системы доставки лекарств, СаСО3, декстрансульфат, гепатома Зайделя.

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-09. Тестирование малых молекул для стимуляции процесса гомологичной репарации концов двуцепочечных разрывов ДНК в локусе CCR5 при трансфекции гемопоэтических стволовых клеток человека мРНК CCR5-Uco-TALEN

Загрузить версию в PDF

Алена И. Шакирова1, Кирилл В. Лепик1, Альберт Р. Муслимов1, Владислав С. Сергеев1, Т. Р. Карпов1, К. И. Аношкин2, Марина О. Попова1, Борис Фезе1,3, Александр Д. Кулагин1

1 НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой, Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
2 Медико-генетический научный Центр им. Н. П. Бочкова, Москва, Россия
3 Отдел клеточной и генной терапии, Департамент трансплантации стволовых клеток, Университетский медицинский центр Гамбург-Эппендорф, Гамбург, Германия

Таргетные инсерции в геном гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) участков белок-кодирующих последовательностей с последующей аутологичной трансплантацией таких клеток является показанием для генной терапии целого ряда моногенных заболеваний человека. Беспрецендентной точностью в этом плане обладает генная терапия с использованием современных инструментов редактирования генома (RNA-guided инженерные нуклеазы, TALEN, ZFN). При их применении процесс протекает за счет так называемого гомологичной репарации (ГР) концов двуцепочечного разрыва (ДР) ДНК, образуемого нуклеазой. Повышение эффективности ГР является актуальной задачей, решение которой позволит с большей эффективностью производить вставки крупных участков ДНК в геном ГСК при доставке донорской репарационной матрицы как вирусными, так и невирусными носителями. Механизмы врожденного иммунного ответа, вызванного повреждением ДНК, представляют собой важный фактор, влияющий на результаты образования ДР, индуцированных инженерными нуклеазами. Целью данной работы является оценка влияния добавления низкомолекулярных ингибиторов TLR9/AIM2/cGAS, STING и антагонистов каспаз A151, H151 и Z-VAD-FMK к культурам первичных ГСК человека на частоту ГР в локусе CCR5 после трансфекции мРНК CCR5-Uco-TALEN.

Материалы и методы

Синтез предварительно кодон-опимизированной посредством деплеции уридина мРНК CCR5-Uco-TALEN был осуществлен компанией Trilink (США). Магнитную селекцию CD34+ ГСК из костного мозга здоровых доноров проводили с помощью набора CD34 MicroBead kit (Miltenyi Biotec). Далее, после активирующей фазы культивирования, осуществляли трансфекцию ГСК мРНК CCR5-Uco-TALEN на приборе Gene Pulser Xcell (BioRad). После трансфекции ГСК в течение суток культивировали при 32°С в среде StemMACS HSC Expansion Media XF (Miltenyi Biotech). Низкомолекулярные ингибиторы A151, H151 и FMK добавляли в концентрациях 4 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, и 25 мкг/мл соответственно за 3 часа до электропорации. Долю событий негомологичного (НГР) сшивания концов разрыва в локусе CCR5 оценивали методом цифровой капельной ПЦР по описанному ранее протоколу (Mock et al., 2015) на приборе Bio-Rad QX200. Для оценки аллельной нагрузки репарированных на основе гомологии разрывов дополнительно методом мультиплексной цифровой капельной ПЦР оценивали количество копий референсного гена EPOR и копий гена CCR5 дикого типа (Schwarze et al., 2021). Разницу между количеством копий референсного гена и суммой аллелей НГР и дикого типа считали долей аллелей, репарированных ГР.

Результаты

Согласно полученным результатам суммарная средняя эффективность нокаута гена CCR5, рассчитанная как сумма репарированных НГР и ГР аллелей, составляла от 9 до 53,5%. Добавление в культуру ГСК малой молекулы FMK значительно отразилось на общей эффективности нокаута гена CCR5, которая в этом образце была максимальной и составляла 53,5%, причем увеличилась частота как НГР (27,2%), так и ГР (26,3%) событий по сравнению с контролем. Добавление Н151 на общей эффективности нокаута гена CCR5 не отразилось (33,5%), причем это касалось также соотношения НГР (18,3%) и ГР (15,2%) аллелей в образцах. В образцах ДНК, выделенной из клеток, культивируемых в присутствии A151, эффективность нокаута гена CCR5 была значительно снижена и составила 9%, причем 95,6% нокаутированных аллелей были результатом НГР в локусах разрывов, формируемых CCR5-Uco-TALEN.

Заключение

Выполнено тестирование эффективности добавления малых молекул в плане стимуляции ГР в первичных гемопоэтических стволовых клетках человека при трансфекции мРНК CCR5-Uco-TALEN. FMK представляется наиболее перспективной из них в плане разработки генной терапии на основе комбинации донорской матрицы и инструментов редактирования генома.

Благодарности

Лепик К.В. благодарит за поддержку Российский фонд фундаментальных исследований, грант No. 19-29-04025mk.

Ключевые слова

TALEN, гомологичная репарация, ингибиторы STING, гемопоэтические стволовые клетки.

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-08. Изучение биораспределения полимерных носителей для дальнейшего использования в генной терапии

Загрузить версию в PDF

Анна С. Рогова1, Анастасия С. Букреева1, Алиса С. Постовалова1, Дарья Р. Ахметова1, Александр С. Тимин1,2, Альберт Р. Муслимов1,2

1 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия
2 Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия

Различные методы генной терапии имеют большие перспективы при лечении различных наследственных, инфекционных и онкологических заболеваний. Тем не менее, в настоящее время эффективность их применения ограничена отсутствием действенных и безопасных методов доставки генетического материала в клетки. Для решения этой проблемы может быть использован следующий метод, заключающийся в доставке генетического материала с использованием полимерных частиц. Одним из важных преимуществ данного метода является структура капсулы, позволяющая обеспечить защиту содержимого ее полости от агрессивного воздействия биологических сред организма. Однако для дальнейшего использования данных носителей в клинической практике необходимо детально изучить их биораспределение после введения в организм. Цель исследования: изучение биораспределения полимерных частиц в организме мыши различными методами, а также гистопатологический анализ тканей после введения носителей.

Материалы и методы

В данной работе использовались полимерные частицы, полученные путем нанесения полиаргинина и сульфата декстрана (PARG/DEXS) по технологии Layer-by-Layer на ядра из карбоната кальция. Ядра были получены путем соосаждения водных растворов солей: карбоната натрия и хлорида кальция с добавлением флуоресцентных красителей FITC и Cy5, а также частиц магнетита. Синтезированные носители были оценены методами световой и конфокальной микроскопии, а также динамического светорассеяния. Далее частицы вводились мышам в хвостовую вену, после чего на 2, 5, 7, 10 и 15 день анализировались их органы (сердце, легкие, печень, селезенка и почки) на приборе для in vivo визуализации флуоресценции – IVIS Spectrum CT. Также были получены данные гистологических срезов с помощью методов визуализации на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе (КЛСМ) и световом микроскопе.

Результаты

В данной работе результаты, полученные методами КЛСМ (частицы, меченные FITC), световой микроскопии (меченные магнетитом) и биолюминографе IVIS (меченные Cy5) коррелируют между собой, однако оценка биораспределение с помощью частиц, меченных магнетитом, не является оптимальной из-за особенностей ткани печени и селезенки. После введения частицы обнаруживаются в большом количестве в легких, предположительно из-за малого размера капилляров и в печени. Далее замечается общее снижение количества частиц в органах. В легких на 10 день количество частиц становится минимальным, в то время как в печени регистрируется достаточное количество. Также, на 10 и 15 день частицы были зарегистрированы в селезенке. Общая картина иллюстрирует отсутствие патологических изменений при использовании полимерных микронных частиц. Наблюдается значительное накопление частиц в тканях с высокоразвитой ретикулоэндотелиальной системой (печень, селезенка, а также легкие).

Заключение

Представленные данные позволяют лучше понять распределение частиц в организме животного в течение длительного времени и предоставить информацию о том, в какие органы потенциально можно доставлять терапевтические агенты с помощью данной системы доставки. В дальнейшем запланированы проведение экспериментов по доставке клинически релевантного генетического материала in vivo.

Благодарность

Работа выполнена при поддержке проекта Российского Научного Фонда «19-75-10010».

Ключевые слова

Полимерные носители, доставка генетического материала, биораспределение, гистологическое исследование, визуализация in vivo.

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-03. Повышение уровня трансфекции при доставке генетического материала полимерными носителями комплексного состава

Загрузить версию в PDF

Анастасия С. Букреева1, Анна С. Рогова1, Татьяна В. Машель3, Дарья Р. Ахметова1, Александр С. Тимин1,2, Альберт Р. Муслимов1,2

1 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия
2 Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
3 Университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия

В настоящее время генная терапия является перспективным направлением для лечения широкого спектра заболеваний. Основным ограничением для развития генной терапии является проблема эффективной доставки генетического материала, так как использование «голых» нуклеиновых кислот не дает желаемого результата. Полимерные носители защищают генетический материал во время транспортировки к клеткам-мишеням, однако необходимо также защитить его и после попаданию в клетку. Фоновая активность нуклеаз считается значительным препятствием для эффективной доставки генов с использованием невирусных векторов. Для решения данной проблемы необходимо подобрать ингибитор, защищающий генетический материал от деградации и положительно влияющий на эффективность трансфекции. Целью данной работы является оценка эффективности пептидного ингибитора ДНКаз II (SLRLLQWFLWAC) на увеличение уровня трансфекции клеток млекопитающих.

Материалы и методы

В работе были использованы полиэлектролитные носители, полученные нанесением по технологии Layer-by-Layer слоев разнозаряженных полимеров (Polyarginine/Dextran sulfate) на ядра из карбоната кальция, предварительно полученные путем соосаждения водных растворов солей карбоната натрия и хлорида кальция. Модельным генетическим материалом являлась плазмидная ДНК, кодирующая зеленый флуоресцентный белок. Были рассмотрены варианты инкапсуляции пДНК в ядро, между полимерными слоями и одновременная запаковка в ядро и в слой. Пептидный ингибитор добавляли к пДНК в соотношении 1:1. Эксперименты ставились на клеточной культуре НЕК 293. Были рассмотрены разные способы засева частиц к клеткам: их добавляли либо к уже адгезированным клеткам, либо частицы предварительно инкубировали с клетками, после чего их засевали на культуральных пластик. Было изучено влияние добавления эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) на эффективность трансфекции. Частицы добавлялись к клеткам в соотношении 100:1. Эффективность трансфекции оценивалась качественно на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе и количественно при помощи проточной цитометрии.

Результаты

Анализ результатов экспериментов показал, что использование пептидного ингибитора ДНКазы II значительно повышает эффективность трансфекции. Наилучший результат был получен при включении генетического материала одновременно в ядро, и в качестве слоя полимерной частицы. Было выявлено, что добавление частиц к адгезированным клеткам, а также использование среды, не содержащей FBS, положительно влияет на уровень трансфекции.

Выводы

В результате работы было исследовано влияние пептидного ингибитора ДНКазы II на эффективность трансфекции, а также выявлены оптимальные условия засева частиц, содержащих генетический материал, к клеткам млекопитающих.

Благодарность

Работа выполнена при поддержке проекта Российского Научного Фонда 19-75-10010.

Ключевые слова

Генная терапия, ингибитор ДНКаз, эффективность трансфекции.

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-02. Доклинические исследования СD20-специфического Car-T клеточного препарата

Загрузить версию в PDF

Татьяна Н. Беловежец, Андрей А. Горчаков, Сергей В. Кулемзин

Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, Новосибирск, Россия

Выраженная клиническая активность CD19-специфичной CAR T-клеточной терапии обеспечила активные исследования в области адоптивной клеточной иммунотерапиии онкологических заболеваний человека и привела к одобрению FDA 5 препаратов. Вместе с тем становится понятно, что необходимо дальнейшее улучшение данного подхода, а именно, обеспечение хоминга и долговременной персистенции, расширение спектра мишеней, снижение стоимости, переход к аллогенному формату. В настоящей работе было проведено сравнение in vitro и in vivo трех различных CD20-специфичных CAR T-клеток с референсным CD19-специфическим CAR на основе антитела FMC63 (Kymriah), первым допущенным к клинической практике.

Материалы и методы

Были получены лентивирусные конструкции, кодирующие CAR с антиген-распознающими доменами от мышиных антител 1F5, Leu16 и человеческого антитела – офатумумаб (2F2). Полученные конструкции отличались только антигенраспознающим доменом. Затем были получены CAR T-клетки из периферических Т-клеток здорового донора и проверена их активность.

Результаты

В первую очередь был оценен уровень экспрессии всех полученных CAR на поверхности клеток при помощи проточной цитометрии. Полученные CAR T-клетки проявляли одинаковую цитотоксичность в 4-х часовом тесте против клеток-мишеней линии Nalm6, эктопически экспрессирующих CD20 (рис. 1). Скорость пролиферации CAR T-клеток с антигенраспознающими районами от 1F5 и FMC63 была примерно в 1,5 раза выше всех остальных CAR T-клеток. В тесте на повторяющуюся цитотоксичность CAR T-клетки на основе 1F5 и Leu16 показали более перспективные результаты (рис. 2). Все полученные CAR T-клетки контролировали ксенотрансплантированую опухоль в мышах линии NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ достоверно лучше, чем нерелевантные CAR T-клетки (специфичные к PSMA) (рис. 3).

Выводы

Таким образом, все полученные CAR Т-клетки проявляют выраженную активность в модельных экспериментах in vitro и in vivo. Основываясь на полученных данных, можно сделать прогноз о перспективности применения таких CAR T-клеток в клинике в моно- или биспецифичном формате.

Исследование было поддержано грантом РФФИ №19-415-543015 р_мол_а.

Ключевые слова

Т-клетки, химерные антигенные рецепторы, терапия CAR T-клетками, офатумумаб.

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-04. Создание in vivo модели терапии рака простаты для исследования противоопухолевого потенциала онколитических вирусов в сочетании с CAR T-клеточной иммунотерапией

Загрузить версию в PDF

Антон Н. Чикаев1, Сергей В. Кулемзин1, Ольга Ю. Волкова1, Татьяна Н. Беловежец1, Анастасия В. Семенова2, Сергей С. Зайнутдинов2, Антонина А. Гражданцева2, Галина В. Кочнева2

1 Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, Новосибирск, Россия
2 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, Новосибирск, Россия

Несмотря на то, что рак простаты неплохо поддается хирургической и гормональной терапии на ранних стадиях, данное заболевание крайне опасно из-за склон- ности к метастазированию и развитию хеморезистетных форм. В связи с этим разработка и тестирование высокоэффективных средств терапии рака простаты являются актуальными задачами. Нами был предложен вариант комбинированной терапии, объединяющий два перспективных подхода к лечению опухолей: CAR-T-клеточную терапию и виротерапию онколитическими вирусами. Первым компонентом выступают T-лимфоциты, «вооруженные» химерным антигенным рецептором со специфичностью к основному антигену рака простаты PSMA (aPSMA-CAR-T). Совместно с aPSMA-CAR-T предлагается использовать рекомбинантный вирус осповакцины штамма Л-ИВП, в геном которого интегрированы гены секретируемых цитокинов GM-CSF и CXCL11 (VV-GMCSF-CXCL11). В дополнение к собственной онколитической активности вируса, данная комбинация трансгенов должна привлекать в очаг опухоли как клетки иммунной системы, так и экзогенно вводимые CAR-Т. Данная работа посвящена созданию in vivo модели для оценки противоопухолевого потенциала исследуемых aPSMA-CAR-T и VV-GMCSF-CXCL11 как в комбинации, так и в формате монотерапии.

Материалы и методы

Нами были получены ксенографты клеток аденокарциномы простаты человека РС3, экспрессирующих PSMA (PC3-PSMA), на мышах линии NOD/Scid. PC3-PSMA вводились животным подкожно в количестве 2*10^6 клеток/мышь. Первая группа животных получала монотерапию VV-GMSCF-CXCL11 на 16-е сутки в виде внутриопухолевых инъекций (10^7 БОЕ/мышь). Мышам из второй группы внутривенно вводили aPSMA-CAR Т-лимфоциты человека (2*10^6 клеток/мышь) на 18-е и 23-и сутки. Третья группа получала оба компонента терапии: однократную внутриопухолевую инъекцию VV-GMSCF-CXCL11 и два системных введения aPSMA-CAR-T в аналогичных концентрациях с теми же временными интервалами. Контрольным группам интратуморально вводили физраствор и внутривенно нетрансдуцированные Т-клетки.

Результаты

Было показано, что однократное введение вируса ингибирует рост опухоли на 90% на 15-е сутки после начала лечения. При этом инъекции PSMA-специфичных CAR-Т клеток человека не имели терапевтического успеха в этой модели ни моноформате, ни в комбинации с виротерапией. Причиной стал недостаточный уровень иммуносупрессии линии NOD/Scid: CAR-T-клетки элиминировались из организма мышей уже на 7-е сутки вследствие реакции «хозяин против трансплантата». Поэтому эксперимент был повторен на более иммунокомпрометированной мышиной линии NSG. Было показано, что в NSG мышах CAR-T способны к персистенции и пролиферации, и, в отличие от модели NOD/Scid, в данном случае наиболее эффективной оказалась монотерапия именно CAR-T-клетками. При монотерапии вирусом, как и при комбинированной терапии, эффективность существенно снижалась. Вероятно, это связано с генерализацией вирусной инфекции на фоне тяжелого иммунодефицита у NSG мышей (количественный ПЦР анализ показал наличие большого числа вирусных частиц в крови животных). Оптимизировать модель можно посредством корректировки дозы вируса, чтобы избежать его негативного воздействия на организм мышей.

Выводы

В целом следует признать, что оба предложенных варианта имеют существенные ограничения и не являются оптимальными трансляционными моделями комбинированной терапии рака простаты. По-видимому, целесообразно использовать иммунокомпетентную мышиную модель с сингенно трансплантированными PSMA+ опухолями, а в качестве терапии – CAR T-клетки мышей.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ мк18-29-09044.

Ключевые слова

Онколитический вирус, CAR-Т, рак простаты, PSMA.

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-05. Длинные некодирующие РНК как потенциальные мишени для геномного редактирования и генной терапии

Загрузить версию в PDF

Антон С. Доме, Дмитрий В. Семенов, Григорий А. Степанов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия

Развитие технологии геномного редактирования и открытие эндонуклеазы RfxCas13d (CasRx) позволяет направлять системы геномного редактирования не только на белок-кодирующие гены, но и некодирующие РНК. Выступая регуляторами процессов транскрипции и трансляции, длинные некодирующие РНК (днРНК) становятся перспективными мишенями для генной терапии. Одним из примеров онкологического заболевания, в развитии которого принимают участие днРНК, является глиобластома. Неполное понимание патогенеза глиобластомы затрудняет разработку эффективной терапии. Изучение патогенеза принято проводить на модельных клеточных линиях. В числе клеточных моделей глиобластомы – линии U87MG, U251MG, U343MG.

Материалы и методы

В рамках данной работы был проведен биоинформатический анализ транскриптомных данных линий клеток U87MG, U251MG и U343MG в сравнении с линиями WI-38, HEK293FT, HEB, BEAS2B, IMR90.

Результаты

По результатам анализа были отобраны три потенциальные днРНК-мишени, имеющие повышенный уровень экспрессии в глиомных линиях по сравнению с группой контрольных линий клеток. Высокий уровень LINC00461 отмечается в клеточных линиях глиомы [1] и у пациентов с множественной миеломой [2]. LINC01152 локализуется преимущественно в ядре, участвует как в регуляции транскрипции генов, в частности, IL-23 [3], так и в посттранскрипционной регуляции, например, взаимодействуя с 3’-UTR MAML2 [4]. При глиобластоме повышенная экспрессия LINC01152 способствует эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП) [5]. Показано, что LINC01272 также способствует ЭМП при раке желудка и колоректальном раке [6].

С использованием системы CasRx нами будут созданы и охарактеризованы клеточные линии с нокдауном выбранных днРНК. Это позволит глубже изучить роль выбранных мишеней в онкогенезе, а также усовершенствовать стратегию поиска и подавления генов-мишеней для генной терапии онкологических заболеваний.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 21-14-00195, а также при частичной поддержке проекта базового бюджетного финансирования Минобрнауки РФ (0245-2019-0001).

Ключевые слова

CasRx, днРНК, глиобластома.

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-07. Лечение онкологических заболеваний микроносителями с использованием комбинированной терапии

Загрузить версию в PDF

Алиса С. Постовалова1, Тимофей Е. Карпов1, Дарья Р. Ахметова1, Альберт Р. Муслимов2, Александр С. Тимин1, Михаил В. Зюзин3

1 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия
2 Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
3 Национальный исследовательский университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия

Рак легкого является наиболее распространенной злокачественной опухолью, одной из наиболее частых причин смертности от рака во всем мире и наиболее распространенной причиной смерти от онкологической патологии. Фактически, существующие и активно использующиеся методы лечения, такие как химиотерапия, лучевая терапия и иммунотерапия, все еще способны вызывать побочные эффекты в нормальных тканях организма при их самостоятельном применении. Именно поэтому необходимо повысить эффективность терапии рака легких путем разработки новых подходов. Методы, основанные на совместном использовании нескольких подходов к лечению, обладают большим потенциалом. Радионуклидная терапия и химиотерапия могут быть определены как одни из наиболее перспективных методов лечения рака легких. Целью данного проекта является изучение эффективности комбинированной лучевой терапии и химиотерапии в отношении рака легких.

Материалы и методы

В этом исследовании было разработано потенциально перспективное лечение с использованием 177Lu-MPs в качестве полимерных микроносителей с участием 177Lu в качестве радионуклида и цисплатина (химиотерапевтического цитостатика) в комбинированной терапии. Мыши линии Balb/c с метастазами в легких получали лечение. После этого легкие мышей изымали и анализировали. В ходе работы эффективность лечения оценивалась путем измерения массы легочных тканей и подсчета количества метастатических легочных узелков на препаратах, окрашенных гематоксилин-эозиом, рассчитанных с помощью Image-Pro Plus.

Результаты

Гистологический анализ показал, что количество очагов метастазирования в легких значительно уменьшилось. Таким образом, была показана наибольшая эффективность комбинированной терапии по сравнению с индивидуальной лучевой терапией 177Lu-MPs и химиотерапией цисплатином.

Вывод

Согласно результатам исследования и полученным данным показана эффективность комбинированной лучевой терапии и химиотерапии в ходе экспериментов in vivo, что является причиной для проведения дальнейших исследований в этом направлении.

Благодарность

Работа выполнена при поддержке ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России.

Ключевые слова

Рак легкого, нанотехнологии, наночастицы, комбинированная терапия, микроносители.

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-06. Модификация наноносителей оксида кремния металлическими оболочками с целью удержания 225AC и его дочерних изотопов

Загрузить версию в PDF

Тимофей Е. Карпов, Михаил В. Зюзин, Александр С. Тимин, Дмитрий О. Антуганов, Альберт Р. Муслимов

«Российский научный центр радиологии и хирургических технологий имени академика А. М. Гранова», Санкт-Петербург, Россия; Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия

В настоящее время альфа-излучающий радионуклид 225Ac является одним из наиболее многообещающих изотопов в альфа-терапии из-за его высокой линейной передачи энергии во время четырех последовательных альфа-распадов. Однако основным препятствием, мешающим полноценно внедрить 225Ac в клиническую практику, является отсутствие стабильного удержания дочерних радиоактивных изотопов (221Fr и 213Bi), что приводит к их свободной циркуляции в организме и разрушению здоровых клеток организма.

Материалы и методы

В данной работе поверхность наночастиц кремнезема (SiO2), полученных с помощью золь-гель метода, была модифицирована металлическими оболочками, состоящими из наноструктур бутоксида титана (Ti(C4H9O)4) и тетрахлоаурата водорода (HAuCl4), для удерживания 225Ac и продуктов его распада в разработанных наноносителях.

Результаты

Исследования in vitro и in vivo на здоровых мышах показали, что металлическое оболочка, нанесенная на поверхность SiO2 наночастиц, способствует удержанию радионуклидов (225Ac и его дочерних изотопов) по сравнению с немодифицированными SiO2 наночастицами в течение длительного периода времени. Немодифицированные титановой/золотой оболочками наночастицы кремния, продемонстрировали утечку 225Ac 20±3% в первые 5 дней и 60%-70% после 15-30 дней инкубации. Напротив, только 0,3% и 2,6% высвобождения 225Ac было обнаружено в случае наночастиц, покрытых титановой и золотой оболочками в течение 30 дней инкубации. Гистологический анализ продемонстрировал, что в течение 3-10 дней после инъекций разработанные наноносители не оказывают значимого токсического действия на системы органов лабораторных мышей. В то же время практически не было обнаружено скопление высвободившихся радионуклидов в нецелевых органах (например, в почках). Напротив, немодифицированные носители продемонстрировали высвобождение свободных радионуклидов, которые распределялись по всему телу животного с последующими морфологическими изменениями в тканях легких, печени и почек.

Выводы

Эти результаты подчеркивают потенциал разработанных наноносителей для использования в качестве систем доставки радионуклидов и предлагают технологию изготовления новых нанотерапевтических агентов. Работа выполнена при поддержке проекта Российского Научного Фонда «19-75-10010».

Ключевые слова

Радиотерапия, наночастицы, радионуклиды, альфа-излучение, силика, титан, золото.

Генная и клеточная терапия: GC-01 – GC-15

GC-01. Разработка методов модификации нано- и микроносителей для in vitro и in vivo визуализации

Загрузить версию в PDF

Дарья Р. Ахметова1, Тимофей Е. Карпов1, Алиса С. Постовалова1, Альберт Р. Муслимов2, Александр С. Тимин1, Михаил В. Зюзин3

1 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия
2 Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
3 Национальный исследовательский университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия

Наночастицы имеют множество преимуществ при их использовании для различных видов визуализации. Данные носителей лекарственных препаратов предполагают широкий спектр возможностей при выборе материалов и легко подвергаются различным видам поверхностных модификаций. Именно поэтому в настоящее время существует большой интерес к данной сфере и разработано множество органических и неорганических наносистем, которые обеспечивают сигнал визуализации, направленность и корректировку фармакокинетики частиц. Несмотря на широкий спектр исследований сочетаний различных видов наночастиц с флуоресцентными красителями и их широкое использование во многих видах исследований, необходимость использования новых технологий и появление усложненных по своей структуре частиц ставит ограничения уже отработанным рабочим протоколам. Целью данного проекта является разработка методов модификации нано- и микроносителей флуоресцентными красителями для in vitro и in vivo визуализации.

Материалы и методы

В работе были исследованы частицы микронных и субмикронных размеров, в качестве матрицы многослойной структуры которых были использованы ядра CaCO3 для полимерных микрочастиц с оболочкой Polyarginine/Dextran sulfate и ядра SiO2 с металлической оболочкой TiO2 в качестве наночастиц. Модификация была произведена методом послойного нанесения полиэлектролитов, адсорбция слоев была доказана измерением изменения ζ-потенциалов. Для оптимизации методик флуоресцентной визуализации были исследованы оптические свойства красителей Cyanine5, Cyanine7 и Rhodamine 800. Для модификации частиц флуоресцентными агентами данные красители были включены в структуру носителей на этапе образования матрицы нано- и микрочастиц. Эффективность разработанных протоколов для мечения носителей флуоресцентными агентами была проверена с помощью методов конфокальной сканирующей лазерной микроскопии (КСЛМ) и биолюминографического исследования.

Результаты

По результатам анализа методами КСЛМ и биолюминографического исследования было доказано, что разработанные протоколы флуоресцентного мечения нано- и микроносителей продемонстрировали свою эффективность для предотвращения высвобождения флуоресцентной метке из структуры носителей. Экспериментальные данные показали, что флуоресцентная метка Cyanine5 является наиболее эффективной благодаря высокой интенсивности излучения и длительности сохранения флуоресцентных свойств.

Выводы

По результатам исследования были получены и экспериментально апробированы методы модификации нано- и микрочастиц флуоресцентными агентами для проведения in vitro и in vivo визуализации.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке ФГБУ «НМИЦ им. В. А. Алмазова» Минздрава России.

Ключевые слова

Нанобиотехнологии, полимерные микрочастицы, наночастицы диоксида кремния, модификация, флуоресцентная визуализация.