Состав и функциональные особенности монослойной культуры пуповинной крови человека

Резюме

Резюме

Введение

В условиях монослойной культуры клетки пуповинной крови способны прикрепляться к пластику и по своей морфологии напоминают культивируемые в сходных условиях мезенхимальные стволовые клетки (МСК) костного мозга. Однако присутствие в прилипающей фракции пуповинной крови МСК до сих пор не является очевидным. Данное исследование выполнено с целью определения состава и ряда функциональных свойств МСК-подобных клеток в монослойной культуре пуповинной крови (МКПК) человека.

Материалы и методы

Исследовали сорок три образца пуповинной крови, полученые в срочных родах на фоне неосложненной беременности у рожениц при атравматичном заборе. Исследования проводили после  19-31 часов хранения образца. Ядросодержащие клетки выделяли на градиенте плотности фиколла (1,077 г/мл), затем помещали в полную культуральную среду, содержащую среду DMEM LG, эмбриональную телячью сыворотку - 30%, пенициллин  (100 Ед/мл), стрептомицин (0,1 мг/мл). Анализ фенотипа монослойной культуры ПК и ее мононуклеарной фракции проводили на проточном цитофлюориметре FACScan. Были использованы следующие конъюгированные флюорохромами антитела: CD34 PE; CD34 FITC, CD45 FITC; CD45 PE; CD14 FITC; CD31 PE; CD31 FITC; CD61 FITC; CD3 FITC; CD19 PE; CD117 PE; HLA ABC FITC; HLA DR.  С целью определения гемостимулирующих свойств монослойной культуры ПК проводили клонирование гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (КОЕ-ГМ) в культуральной системе «агаровая капля-жидкая среда». В качестве источника колониестимулирующей активности ПК использовали МКПК. Клетками-мишенями были КОЕ-ГМ мононуклеарной фракции ПК, дающие клональный рост в агаровой культуре. Для индукции дифференцировки МСК-подобных клеток ПК в адипогенном и остеогенном направлении клетки помещали в полную среду с добавлением  дексаметазона (1х10^-7 М); инсулина (1х10^-9 М) или β-глицерофосфата (7х10^-3 М); дексаметазона (1х10^-8 М); аскорбиновой кислоты (2х10^-4 М) соответственно. Оценка экспрессии генов (CDH11,VCAM1, ITGB1, IL6ST, TFRC, ALCAM, MPL, TPO, ENG, NT5E, IL6R, BGLAP, COL1A2, AFP, LPL, ACTA1, TNNI3, TPM1)  проводилось методом RT-PCR (амплификация продуктов обратной транскрипции).

Результаты

В большинстве случаев культура клеток, прилипших к пластику была гетерогенна: наблюдали узкие веретенообразные клетки и большие полигональные. В ряде образцов обнаруживали небольшие колонии (до 100 клеток). В 3 из 43 исследованных образцов ПК наблюдали крупные колонии, численностью более 1000 плотноупакованных, имеющих типичную для фибробластов веретенообразную форму клеток. При анализе преобладающих клеточных типов было выявлено, что большую часть прикрепленных к пластику клеток составляли гемопоэтические клетки (медиана 60,17%). Около трети от всей СD45-положительной популяции составляли СD14-положительные клетки. Остальные негемопоэтические клетки представляли собой фенотипически гетерогенную популяцию. На фоне длительного культивирования и последовательного пассирования фенотип культуры меняется – отмечается элиминация из культуры гемопоэтических клеток и увеличение доли МСК и ЭКП. При инициации культуры значительно изменяется соотношение ГСК- и ЭКП-подобных клеток среди CD34-положительной популяции в пользу ЭКП. МСК-подобные клетки МКПК способны к дифференцировке в адипоциты и остеобласты, что подтверждается специфической окраской и свидетельствует в пользу их функциональной состоятельности. В ряде культур индукция дифференцировки инициировала открепление большей части клеток. Прилипающая фракция первичной монослойной культуры оказывает стимулирующее влияние на колониеобразование КОЕ-ГМ, по характеру и силе воздействия близкое стандартному лейкоцитарному фидеру. Преимущественное влияние на их пролиферативную активность оказывают клеточные элементы с маркерами МСК (CD90⁺CD31^-). Удлинение временных параметров получения и хранения образцов ПК приводят к снижению гемостимулирующей активности. При сравнении экспрессии ряда генов выявлено, что профиль экспрессии МСК костного мозга и клеток МКПК идентичен за исключением тромбопоэтина, экспрессия гена которого не отмечалась в МКПК.

Заключение

Пуповинная кровь содержит субпопуляции клеток негемопоэтического происхождения,  фенотипически и функционально сходных с МСК костного мозга. Однако их низкая концентрация, а также сниженная репопулирующая активность в стандартных культуральных условиях, ставят под сомнение возможное использование ПК в качестве альтернативного источника МСК.

Ключевые слова

мезенхимные стволовые клетки, пуповинная кровь человека, иммунофенотипирование, культура клеток